Mein Invitro Versuch

[Fabian Z.]

Hallo zusammen,

bin gerade in der Vorbereitung für meinen ersten Invitro-Versuch. Hier stellen sich für mich aber noch ein paar Probleme.

1. Wie kann man steriles Wasser aus destilliertem Wasser gewinnen? (Ich bin im Besitz eines Sterilisators)

2. Wie bringt man 30%ige H2O2 Lösung auf eine3%ige H2O2 Lösung?

3. Habe mir aus einem Aquarium eine Sterilkammer gebaut, indem ich es auf die Seite gekippt habe und mit einer Plexiglasscheibe, die zwei Löcher für die Hände hat verschlossen. Aber was mache ich mit diesen Löchern bzw. wie verschließe ich sie nachdem ich mit meinen Arbeiten in der Sterilkammer fertig bin?

4. Außer diesen 2 Löchern für die Hände ist die Sterilkammer absolut dicht. Da ich diese Löcher auch noch verschließen will stellt sich für mich die Frage: Brauch die Sterilkammer eine Belüftung?

5. Mein letztes (und wichtigstes) Problem betrifft die Gefäße in die das Medium und damit auch die Pflanzen reinkommen. Als erste Möglichkeit hätte ich verschließbare Petrischalen(aus Plastik), die extra für das kultivieren von Pilz- oder Krankheitskulturen hergestellt werden. Aber diese sind extrem flach und es wäre über dem Medium nur noch ca. ein halber cm für die Pflanzen Platz. Außerdem weiß ich nicht, ob Petrischalen die Temperaturen (120-140°C) beim sterilisieren aushalten. Eine andere Möglichkeit wären Marmeladen- oder Babygläser. Allerdings sind diese wesentlich größer und mein Hauptproblem bei diesen ist, dass sie einen undurchsichtigen Deckel haben und ich so meine LSR zum beleuchten irgendwie seitlich installieren müsste.

Die letzte Möglichkeit die ich habe sind verschließbare Reagenzgläser. Das Problem dabei ist nur, dass sie nicht von alleine stehen und jeder überflüssige Teil in der Sterilkammer muss wieder neu sterilisiert werden. Außerdem sind sie (relativ) klein. Was ich hier als Vorteil betrachte ist, dass man extrem viele Kulturgefäße anlegen kann und somit Kulturgefäße, die mit Schimmel etc. befallen sind, leichter aussortieren kann.

Muss ich eine Belüftung in diese Kulturgefäße einbauen? Wenn ja wie?

Freue mich auf zahlreiche Antworten.

Werde, wenn ich die Zeit dazu finde, einen Bericht über diesen Versuch ins Forum stellen.

Gruß Fabian

Bearbeitet 18. Februar 2006 von Gast

[Gast Frank Uliczka]

Hallo Fabian,

1. Wasser in ein Gefäß füllen (z.B. Marmeladenglas)und ab in den Autoklaven

2. Du machst ganz einfach eine 1:10 Verdünnung. Soll heißen du nimmst z.b. 10 ml 30%ige H2O2 + 90 ml H2O

3. Ich kann mir deine Sterilkammer nicht richtig vorstellen. Du willst die komplett verschließen? Hast du schon einmal daran gedacht, dass die Gefäße, die du in die Sterilkammer einführen willst nicht steril sind und das komplette Abdichten daher überflüssig ist? Oder verstehe ich dich falsch?

4. Normale Sterilwerkbanken haben eine Lüftung und sind daher niemals völlig abgedichtet. Wie man so eine Lüftung in ein Auqarium einbauen kann weiß ich allerdings auch nicht. Wisch die Arbeitsfläche vor Gebrauch am besten mit 70% Ethanol ab - das tötet kurzzeitig alles ab.

5. Ich kann MAGENTA B-CAP zu kaufen bei Sigma-Aldrich empfehlen

mfg, Frank

[Fabian Z.]

Wasser in ein Gefäß füllen (z.B. Marmeladenglas)und ab in den Autoklaven

hab blos gedacht, dass das Glas, wenn es verschlossen ist, dem Druck nicht mehr stand halten kann und wenn es offen ist das ganze Wasser verdampft.

Ich kann MAGENTA B-CAP zu kaufen bei Sigma-Aldrich empfehlen

sind mir eigentlich ein bischen zu teuer, hab deshalb nochmal Fotos von mir zur Verfügung stehenden Gefäßen gemacht. Ich denke am brauchbarsten sind die verschließbaren Reagenzgläser. Brauchen die eine Lüftung?

s. Bild

Ich kann mir deine Sterilkammer nicht richtig vorstellen.

siehe Fotos.

und hier noch meine Chemikalien: s. Bild

ansonsten sind in meiner Ausrüstung noch Skalpell, Feinwaage, Pinzette...

Die Zutaten fürs Medium müssten auch bald eintreffen.

Freue mich über sämtliche Antworten, die meine Fragen betreffen.

Gruß Fabian

Bearbeitet 24. April 2006 von Gast

[Gast carnivoren]

Hallo,

das H2O2 in der Bierflasche finde ich besonders "toll".

Noch nie was von Unfällen durch Verwechselung von Chemikalien in Getränkeflaschen gehört?

carnivoren

[Giovanni Schober]

Hallo,

Ein normal denkender (und sehfähiger) Mensch übersieht auch den großen Aufkleber mit H2O2 nicht, vor allem dann, wenn er Ordnung hält und die Flasche nicht in den Bierkasten stellt, aber das ist sicher nicht Thema des Threads.

Giovanni

Bearbeitet 19. Februar 2006 von Gast

[Gast]

hallo zusammen

Hat jemand schon mal seine sachen(Petrischalen, Nährmedium...) mit dem Steamer sterilisiert? geht das überhaupt? und wenns geht, bei wieviel Grad muss man das zeugs sterilisieren?

cédric

[Gast Frank Uliczka]

Hallo,

autoklaviert wird normalerweise für 20 bis 30 min bei 121°C und 1 bar Überdruck. Mit heißem Dampf alleine wird das nicht funktionieren. Hat ein Steamer denn Überdruck?

Und wenn du das ganze zu heiß werden lässt, dann gehen dir deutlich mehr von den Phytohormonen kaput. Man sollte also irgendwie auch die Temperatur bei der Sache im Auge behalten.

mfg,

Frank

[Fabian Z.]

Noch nie was von Unfällen durch Verwechselung von Chemikalien in Getränkeflaschen gehört?

die steht in einem abschließbaren "Giftschrank" mit anderen Chemikalien und ich glaube die Gefahr einer Verwechslung ist sehr gering.

Hat jemand schon mal seine sachen(Petrischalen, Nährmedium...) mit dem Steamer sterilisiert?

was ist ein Steamer? Ich habe zum sterilisieren einen Autoklav.

Ich brauche unbedingt noch konstruktive Antworten zu folgenden Punkten:

- Muss die Sterilkammer belüftet sein?(ich will die Kulturgläser auch in dieser Kammer lassen und beleuchten, damit ich eine Kontanimation weitgehend ausschließen kann)

- Müssen die Kulturgefäße belüftet sein?

- Welche Kulturgefäße soll ich nehmen?

Gruß Fabian

[Oliver Groß]

Hallo Fabian,

eine Sterilkammer hat nur die Aufgabe, dass es zu keiner Kontanimation kommt, während die Kulturbehälter geöffent sind. Sobald diese wieder in einer sterilen Umgebung verschlossen wurden, können keine Keime eindringen. Es sei, sie schließen nicht luftdicht ab.

Also macht eine Belüftung nur in soweit Sinn, dass sie verhindern soll, dass die Glässer beschlagen und man nichts mehr sieht. Hierzu muss aber dann die Luft durch einen Luftfilter, der Keime abhält. Z.b. mit einem HEPA-Filter wird dies ermöglicht.

Sobald die Samen gekeimt haben, müssen die Kulturbehälter belüftet werden. Dazu gibt es einmal Pads, die wie ein Filter funktionieren (d. h. Keime abhalten und einen Gasaustausch ermöglichen). Es geht auch, wenn sterilen Watte in das Kulturbehälter gestopft wird. (geht aber nur bei Behältern mit engem Hals (Kolben oder Reagenzglässer o.ä.). Es gibt auch Behälter, die eiinen Deckel mit solchen Filter haben.

Wie gesagt, Kolben, Reagenzgläser, kleine Glässer aus dem Haushalt (Soßenglässer zb.).

Ciao Oliver

[Gast Philipp Gießibl]

Hi,

ich habe vor einiger Zeit die Invitro-Kulturen von Stefan Ippenberger gesehen, der folgendermaßen vorgeht:

- Als Kulturgefäße dienen normale Marmeladengläser (können aber beim Sterilisieren Sprünge bekommen) und Reagenzgläser aus Plastik (stehen in speziellen Halterungen)

- Auf jedem Marmeladenglasdeckel klebt ein Stück Hansaplast, unter dem sich vermutlich die Belüftungslöcher befinden

- Soweit ich mich erinnern kann, wird von oben beleuchtet, d.h. viele Pflanzen müssen mit recht wenig Licht auskommen, was aber invitro nicht besonders schlimm zu sein scheint

- Die Kulturgefäße stehen direkt im Regal des Heizungskellers, werden also nicht durch eine Sterilkammer geschützt

MfG Philipp

[Fabian Z.]

Es geht auch, wenn sterilen Watte in das Kulturbehälter gestopft wird.

kann ich Watte einfach so bei 120°C autoklavieren?

Als Kulturgefäße dienen normale Marmeladengläser (können aber beim Sterilisieren Sprünge bekommen) und Reagenzgläser aus Plastik (stehen in speziellen Halterungen)

werde jetzt wahrscheinlich die Petrischalen versuchen und sowohl verschließbare Plasiik- und Glasreagenzgläser.

Was nimmt man eigentlich für Nährmedien für Karnivoren?

Ich bekomme jetzt Murashige & Skoog medium, Knudson C Orchid Medium gemischt mit Sucrose und Pant agar. Dann habe ich noch eine M&S Vitaminmixtur und BAP für bessere Teilung.

Hier mein Plan wie ich vorgehen will bzw. was ich mir für Informationen zusammengesucht habe(verkürzte Form):

Schritt1: Sterilisation aller Arbeitsmaterialien und mir selbst

Schritt2: Sterilisationen der Gläser + der Nährmedien:

1-1,5cm Medium in die Gläser

alles zusammen sterilisieren bei 120-125°C; 1bar; 15 min

Schritt3: Sterilisation der Samen/Pflanzenteile:

Samen:

5 min in Isoprophylalkohol

3 min in Chlorix Lösung 1:10 + ein Tropfen Spülmittel

1-2 min in 3%ige H2O2 Lösung

Pflanzenteile:

2-3cm große Teile für 10-20 min in Chlorix Lösung 1:4 + 1 Tropfen Spülmittel

Zeiträume können variieren

Schritt4: Samen/Pflanzenteile (bei sterilen Bedingungen) auf das Medium setzten

Schritt5: Wachstum unter LSR

Schritt6: Pflanzen an normale Bedingungen gewöhnen:

Vor dem einpflanzen in normales Substrat muss das ganze Medium abgewaschen werden

[Oliver Groß]

Es geht auch, wenn sterilen Watte in das Kulturbehälter gestopft wird.

kann ich Watte einfach so bei 120°C autoklavieren?

Ja, nur ich würde dann die Watte mit Alufolie umwickeln.

Schritt3: Sterilisation der Samen/Pflanzenteile:

Samen:

5 min in Isoprophylalkohol

3 min in Chlorix Lösung 1:10 + ein Tropfen Spülmittel

1-2 min in 3%ige H2O2 Lösung

Pflanzenteile:

2-3cm große Teile für 10-20 min in Chlorix Lösung 1:4 + 1 Tropfen Spülmittel

Findest Du nicht dass Du bei der Sterilisation der Samen etwas übertreibst? Nicht dass deine Samen später so steril sind, dass sie nicht mehr keimfähig sind. Ich habe jetzt gelesen (an Praxis fehlt es mir noch, deshalb ist dies keine Kritik, sondern nur eine Meinung von mir), dass es reicht, Samen mit H2O2 oder Chlorix keimfrei zu machen. Aber Isoprophylalkohol + H2O2 + Chlorix ist doch etwas viel, oder?

Ciao Oliver

[Nestor]

Hallo,

kurze Zwischenfrage. Ist dein Medium sicher hitzesterilisierbar oder gibt es Komponenten, die man lieber getrennt bzw. anders sterilisiert?

mfg Björn

[Fabian Z.]

Findest Du nicht dass Du bei der Sterilisation der Samen etwas übertreibst?

Kann ich nicht sagen. Die Informationen habe ich von folgender Seite:

http://www.omnisterra.com/botany/cp/slides/tc/tc.htm

Falls noch Ideeen kommen bin ich gerne dafür offen. Ansonsten werde ich frei nach dem Prinzip vorgehen: Probieren geht über studieren.

Gruß Fabian

[Gast]

hallo

ich habe noch mal eine andere frage:

ist das auf den fotos das meristem?

für die invitro-kultur entnimmt man ja meristem-zellen. Und wenn es kein "zipfel" wie auf dem foto hat,entmimmt man die zellen am stengel an der blattbasis oder unten am rhizom? an welchem teil der pflanze schadet es ihr am wenigsten?

mfg

cédric

[Gast Frank Uliczka]

Rein theoretisch kann aus jeder einzelnen Zelle einer Pflanze eine neue Pflanzen entstehen (Totipotenz). Du kannst Nimm einfach ein Stück vom Blatt nehmen.

mfg,

Frank

[Andreas Wistuba]

Rein theoretisch kann aus jeder einzelnen Zelle einer Pflanze eine neue Pflanzen entstehen (Totipotenz).

Das ist leider bei sehr vielen Pflanzen (z.B. Nepenthaceen, Sarraceniaceen, ...) noch niemandem geglückt. Es ist immer ein Unterschied, ob man aus Zellen u. U. sogar Kallus bekommt, oder ob es zur Regeneration von Pflänzchen kommt.

Gruß

Andreas

[Flipp]

Hallo zusammen,

ich habe mir von DUCHEFA MS besorgt. Kann man damit In Vitro kulturen von Carivoren anlegen??

Hat jemand Erfahrung mit In Vitro Kulturen von DUCHEFA Produkten??

In den meisten Foren benutzen die Anwender SIGMA Produkte.

Gruß

Danke

[Oliver Groß]

Hallo Flipp,

ich habe demnächst vor, mit MS-Medien von DUCHEFA Kulturen mit Canivoren zu versuchen.

Es ist im Grunde egal, ob das Medium von DUCHEFA oder SIGMA ist. Denn MS-Medien haben die gleiche Zusammensetzung, nur nur von verschieden Herstellern. MS steht für Murashige und Skoog (war/en das der/die dieses Zusammensetzung zum erstenmal benutzen?). Und DUCHEFA oder SIGMA nutzen beides das gleiche Rezept dafür.

Ciao Oliver

[Thomas G]

Hallo,

ich würde mich freuen, wenn hier auch mal über die Erfolge der i-v Versuche berichtet würde.

Ich kann mir schwerlich vorstellen, dass man ohne Sterilbank mit irgendwelchen Aquarien oder sonstwelchen Kästen ein so steriles Umfeld erzeugen kann, daß nicht 80% der Kulturen kontaminiert werden. Ich habe selbst beruflich mit Zellkulturen zu tun und weiß, wie schnell man sich Kontaminationen in antibiotikafreien Medien einfängt. Überlegt mal, ob der Nutzen, den ihr aus solchen Experimenten zieht, das viele Geld wert ist, das reingesteckt werden muß. Dafür würde ich mir ehrlich gesagt lieber Pflanzen zulegen.

Gruß

Thomas.

[Gast Martin Rümmler]

Hallo allerseits!

mich persönlich interessiert ja die in-vitro Vermehrung auch sehr. Welche Frage sich mir aber immer aufdrängt, wenn ich solche threads lese,...rentiert sich die ganze Sache im Endeffekt für euch?! Wenn man nicht gerade Zugang zu Laborbedarf hat, ist die ganze in-vitro Geschichte mehr als umständlich und teuer. Und wenn es nur darum geht seine Drosera capensis zu vermehren, fährt man wesentlich besser, einfach die Samen auf Torf auszustreuen und zu warten!

@Fabian

Zu der Frage mit der Belüftung deiner Sterilkammer. Am besten ist es, sie wäre ringsum geschlossen. Dann wäre nämlich gewährleistet, dass kein Luftzug irgendwelche Bakterien und Pilze in deine Kammer wirbelt. Da du ja aber darin eigentlich (steril) arbeiten willst, brauchst du natürlich Öffnungen....und das ist ein Problem. Die Belüftung herkömlicher Sterilbänke, die du ansprachst, ist im Grunde keine Belüftung sondern ein steter Strom keimfreier Luft. Dabei wird die Luft durch Filter gejagt, die jegliche Pilz- und Bakteriensporen zurückhalten. Und das die sterilen Arbeitsflächen manchmal vorne sogar weite Öffnungen haben, geht nur deshalb, weil der Luftstrom von der Decke bzw. der Rückwand der Arbeitsbank kommt und kontinuirlich zur offenen Seite hin ausströmt!

Eine oberflächliche Desinfektion mit 70% Ethanol ist ratsam aber auf alle Fälle nicht ausreichend um alle Keime zu töten!

Auch die Kulturgefäße müssen nicht belüftet werden,...selbst dann nicht, wenn die Samen gekeimt sind. Solange das Medium genügend Nährstoffe enthält und die Pflanze gut gedeiht, gibt es eigentlich keinen Grund, sie raus zu nehmen.

15 min bei 121°C und einem bar Druck ist die übliche Prozedur für die Sterilisation von Medien in einem Autoklaven. Länger als 20 min würde ich nicht unbedingt empfehlen, da Bestandteile des Mediums darunter leiden könnten. Es gibt bestimmte Phytohormone, die man keinensfalls mit autoklavieren sollte. BAP gehört allerdings nicht dazu.

Was das Autoklavieren von Kulturgefäßen angeht, nutzt man eigentlich immer Glasprodukte. Kunststoff ist für solche Temperaturen meistens nicht geeignet. Inwieweit deine Reagenzgläser die feuchte Hitze von 121°C überstehen, weiß ich nicht. Aber bei den Petrischalen gehe ich davon aus, dass sie höchstwahrscheinlich schmelzen bzw. sich zumindest verformen werden.

Für die Kultur nutzt man fast ausschließlich Einweggefäße aus Kunststoff, die steril geliefert werden.

Wenn du deine Marmeladengläser autoklavierst, öffne den Deckel leicht. Dann kann der Überdruck ohne weiters entweichen und du hast auch nicht das Problem eines Siedeverzuges des Mediums nach dem autoklavieren.

Was die Sterilisationsdauer deiner Samen angeht, hilft, wie du schon geschrieben hast, meist nur ausprobieren. Je nach Beschaffenheit und Eigenschaften der Samenschale unterscheiden sich die maximalen Sterilisationszeiten von Art zu Art.

Bei Pflanzenteilen sieht es gar schwieriger aus. Denn hier schützt keine robuste Schale die Pflanzenzellen. Es ist schwer, genau die Methode zu finden, die zwar alle Keime tötet, gleichzeitig aber nicht auch die Pflanzenzellen in Mitleidenschaft zieht. Und wie schon Andreas geschrieben hat, ist es leider nicht immer ohne weiteres möglich ganze Pflanzen aus einzelnen Zellen zu regenerieren.

Ich hoffe, ich konnte ein paar Tipps geben und wünsche viel Erfolg beim "Züchten"

Viele Grüße,

Martin

Bearbeitet 30. Mai 2006 von Gast

[Fabian Z.]

Was das Autoklavieren von Kulturgefäßen angeht, nutzt man eigentlich immer Glasprodukte. Kunststoff ist für solche Temperaturen meistens nicht geeignet. Inwieweit deine Reagenzgläser die feuchte Hitze von 121°C überstehen, weiß ich nicht. Aber bei den Petrischalen gehe ich davon aus, dass sie höchstwahrscheinlich schmelzen bzw. sich zumindest verformen werden.

so, ausprobiert und deine Aussage wird hiermit bestätigt: alles aus Plastik hat den Autoklav nicht überstanden.

Für die Kultur nutzt man fast ausschließlich Einweggefäße aus Kunststoff, die steril geliefert werden.

Aber: Wenn ich das Medium in einem Glasgefäß sterilisiere, wie kann ich es dann in die sterilen Röhrchen bringen bzw. ist das Medium dann noch so flüssig? Außerdem denke ich, dass beim Umfüllen noch einmal erhöhte Kontaminationsgefahr herrscht.

Deswegen habe ich jetzt vor das Medium direkt in Glasreagenzgläsern zu sterilisieren und dann mit steriler Watte zu verstopfen. Was denkt ihr davon?

Gruß Fabian

Bearbeitet 25. Februar 2006 von Gast

[Gast Martin Rümmler]

Hi Fabian,

Aber: Wenn ich das Medium in einem Glasgefäß sterilisiere, wie kann ich es dann in die sterilen Röhrchen bringen bzw. ist das Medium dann noch so flüssig? Außerdem denke ich, dass beim Umfüllen noch einmal erhöhte Kontaminationsgefahr herrscht.

Nach dem Autoklavieren ist das Medium noch ne Weile flüssig. Wobei es davon abhängt, ob du Agar, Gelrite oder etwas anderes zum Verfestigen des Mediums nimmst. Gelrite härtet etwas schneller aus.

Das Umfüllen in die Kulturgefäße stellt also kein Problem dar. Allerdings hast du recht, dass sich dabei die Gefahr einer Kontaminations nochmals erhöht. Das Medium gleich in den Reagenzgläsern zu autoklavieren, ist eine gute Alternative. Du kannst zum Verschließen der Rörchen auch stabile Alu-folie nehmen. Da aber deine Röhrchen wahrscheinlich keine Wulst an der Öffnung haben, wird die Folie wohl nicht so gut halten. Deswegen würde ich die Watte sicherheitshalber auch noch mit reinstopfen.

Grüße,

Martin

Bearbeitet 26. Februar 2006 von Gast

[Flipp]

Hallo,

gestern habe ich meinen Ersten In-Vitro Versuch nach dem Rezept von Lotte & Thomas Orchideen durchgeführt.

Allerdings verwendete ich MS mit Vitaminen von DUCHEFA.

Das grösste Problem war das möglichst sterile arbeiten.

Habe 70 % Ethanol sowie 3% Wasserstoffperoxid und 1,5 % Wasserstoffperoxid verwendet.

Normale kleine Marmeladengläser wurden abgekocht.

Bin mal gespann ob es was wird.

Gruß

[Fabian Z.]

So,

heute sind meine letzten Utensilien angekommen, die ich noch brauche und ich will morgen anfangen.

Jetzt habe ich aber noch eine Frage zum Medium, da ich unterschiedliche Angaben gelesen habe wie man es anmacht.

Muss ich die Zutaten des Mediums in heißes Wasser einmischen oder kann ich sie auch einfach direkt in kaltes Wasser mischen?

Danach sterilisier ich es sowiso noch einmal.

Gruß Fabian