Mein Invitro Versuch

[Henry M.]

Hallo,

@ Fabian: Du kannst es kalt anmischen, natürlich in Reinstwasser! Und denk dran den pH zu prüfen ;-) (der angesetzten Medium-Lsg., nicht des Wassers). Liegt bei meinem 1/2 MS nach dem Anrühren immer irgendwo zwischen 5 und 6.

@ Flipp: Mit abkochen allein wird das aber nicht steril sein. Das Medium mußt du auch steril machen, also alles am besten autoklavieren! Das Medium kannt du natürlich auch steril filtrieren.

Gruß

Henry

Bearbeitet 4. März 2006 von Gast

[Stefan]

edited to allow a friend a closer view on my iv-plants:

Hallo,

ich habe mir lange überlegt, ob ich in diesem Beitrag noch antworten soll, weil dies anscheinend bei iv-Themen immer mit besonderen Schwierigkeiten etc. verbunden ist. Ich erinnere mich da an einen Streit, der wohl mit dafür verantwortlich war, dass eines unserer Forenmitglieder mit der meisten Erfahrung vergrault wurde und das Forum verließ, an Beiträge mit fachlich völligem Un-sinn, der zum Teil sogar zur Gefährdung der Experimentatoren führen könnte und andere. Aber sei´s drum:

ich würde mich freuen, wenn hier auch mal über die Erfolge der i-v Versuche berichtet würde.

Habe ich schon mehrfach getan, hier ein weiteres Beispiel von D. pauciflora, die ich gestern aus dem Glas genommen habe:

Ich kann mir schwerlich vorstellen, dass man ohne Sterilbank mit irgendwelchen Aquarien oder sonstwelchen Kästen ein so steriles Umfeld erzeugen kann, daß nicht 80% der Kulturen kontaminiert werden.

Da stimme ich Dir zu 100% zu, alles, was mit Kochtöpfen und irgendwelchen Kästen zu tun hat, ist meiner Ansicht nach zum Scheitern verurteilt. Außerdem sollte man den Faktor Mensch nicht vergessen, wer nicht eine grundsolide Ausbildung in Steriltechnik genossen hat (egal in welcher Sparte!), wird wohl immer zum Scheitern verurteilt sein. Das deutet sich auch an, weil hier im Forum keinerlei Erfolgsmeldungen aufgetaucht sind (leider auch keine von den wohl zahlreich vorkommenden Misserfolgen). Die Bilder von Henry mal als Ausnahme, der aber auch über das nötige Laborumfeld verfügt.

Überlegt mal, ob der Nutzen, den ihr aus solchen Experimenten zieht, das viele Geld wert ist, das reingesteckt werden muß.

Auch das habe ich getan Thomas. Für mich persönlich kann ich die Frage folgendermaßen beantworten: Der rein pekuniäre Nutzen, sprich wirtschaftliche Erfolg in Form von Euronen, ist für Hobbyisten nicht gegeben. Die Einnahmen könnten eventuell die Ausgaben decken, aber das ist alleine bei dem hohen Stromverbrauch für die Neonröhren schon fraglich. Und ein anständiger Autoklav zieht auch mehrere kW aus dem Netz.

Den eigentlichen Nutzen sehe ich für mich persönlich in der Möglichkeit, Species zu vermehren, die ich sonst nicht vermehren könnte und schon gar niacht in dieser Zeit. Als Beispiel die abgebildeten D. pauciflora: Diese Pflanzen sind jetzt ca. ein Jahr oder etwas weniger alt und werden in der nächsten Saison definitiv blühen. Pflanzen, die ich im Spätsommer 2005 ausgepflanzt habe (damals ca. ein halbes Jahr alt), blühen derzeit noch. Bei Anzucht auf normalem Substrat, Einhaltung der Ruhezeiten (Sommer) etc. könnte ich vielleicht nach 4-5 Jahren mit ersten blühfähigen Pflanzen rechnen. Das spart mir also 3-4 Jahre Kultur.

Bei z.B. D. coccipetala gab es weltweit ca. 20 Pflanzen in Kultur. Ob diese Pflanze je wieder in der Natur gefunden werden kann, ist fraglich. Durch iv- Vermehrung konnte ich letzten Herbst erste Töpfe dieser Species abgeben, weitere werden folgen, allerdings ist mein Anzuchtplatz ziemlich limitiert. Ohne iv-Vermehrung gäbe es definitiv keine Pflanzen im Handel bzw. der Sammeldruck wäre ziemlich hoch.

Nehmen wir die kommerziellen Anbieter als Beispiele:

Eine H. minor war noch vor ca. 20 Jahren weltweit praktisch nicht im Handel erhältlich. Ich kann mich gut erinnern, wie ich mir die Nase vor den Terrarienscheiben in München plattgedrückt habe, um nur mal eine sehen zu dürfen. Man kann sicher mit Recht behaupten, dass damals quasi jede einzelne Pflanze eine Naturentnahme war. Heute ist diese Species von verschiedenen Tafelbergen in praktisch beliebiger Menge erhältlich, weil unter anderen obige Anbieter sie durch iv-Vermehrung billig anbieten können. Dies führt dann leider auch soweit, dass wie beim Regiotreff in Würzburg große, traumhaft gewachsene H. minor Pflanzen mit adulten Schläuchen für 10 Euronen gehandelt werden und noch nicht einmal reißenden Absatz finden (gehört nicht direkt hierher, musste ich aber auch mal loswerden!). Verkehrte Welt, wir wären vor nicht allzu langer Zeit überall in Europa hin gefahren, um eine H. minor zu ergattern --> alles Erfolge der iv-Kultur.

Was ich damit sagen will ist, dass der Sammeldruck auf die natürlichen Populationen der Pflanzen drastisch reduziert wurde und wird und alleine dies halte ich aller Anstrengungen wert.

Jetzt reichts glaube ich erst einmal

Stefan

Bearbeitet 10. März 2006 von Gast

[King]

Bin ein sehr erfreuter Leser in sachen iv artikel und das freut mich mal das sich endlich mal wieder einer gut entwickelt hoffentlich bleibt das so. Habe es selbst auch schon einmal probiert, mit Kochtopf usw... es ist wirklich nicht leicht alles Steril abzulaufen zu lassen. Darum wollte ich einmal fragen wie es aussieht mit Pflanzenteilen zu sterilisieren. Hat da jemand erfahrung Samen sind da ja nicht so heikel nur eben die pflanzeteile. Zu kurz sterilisiert hilft nichts und zu lange und schon sind die Zellen kaputt. Darum wollte ich fragen mit was ihr eure Pflanzenteile genau sterilisiert und wie lange??

[Fabian Z.]

Hallo zusammen,

habe nun gestern in stundenlanger Arbeit meine ersten 50 Reagenzgläser gefüllt. Habe mein bestes gegeben um Kontaminationen zu vermeiden. Aber natürlich bin ich mir bewusst, dass wahrscheinlich nicht mehr als die Hälfte der Reagenzgläser durchkommt, aber mit einem Ergebniss mit 50% wäre ich durchaus zufrieden. Nätürlich werde ich auch weiterhin von meinen (Miss-)Erfolgen berichten.

Mit folgenden Arten sind die Reagenzgläser besetzt:

S. flava var maxima

B. liniflora (unten zu sehen)

D. regia

D. filiformis var filiformis

D. filiformis var tracyii

D. indica

D. intermedia 'Brazil'

D. burmanni auch Pflanzenteile (unten zu sehen)

D. paradoxa nur Pfalnzenteile (unten zu sehen)

Gruß Fabian

[Henry M.]

Hallo,

wenn man alles richtig macht und steril gearbeitet hat, dann erhält man Ergebnisse wie auf dem nachfolgendem Bild zu sehen.

http://forum.carnivoren.org/attachment.php?id=905&

Dr peltata iv u.Jpg

Kann Stefan da aus eigener Erfahrung nur 100%ig zustimmen, ohne die Erfolge in der iv-Kultur könnte nur ein sehr sehr kleiner Teil von uns seine karnivore Sammelleidenschaft befriedigen. Von vielen Arten würde es nur wenige Exemplare in den Sammlungen geben (wären Raritäten) und erhältiche Pflanzen wären extrem teuer. Durch die iv-Kultur sind Wildsammlungen unrentabel, was die Naturstandorte wenigsten vor Zerstörung durch Plünderungen schützt.

Selbst Dionaea werden iv vermehrt, so daß sie im Baumarkt so billig angeboten werden können:!:

Gruß

Henry

[Gast Volker_Morath]

Also, da sich nun viele zum Thema geäußert haben, möchte nun auch ich mal meinen Senf dazu geben.

Vorab auch von mir einen "Satz der Hoffnung", wie man bis jetzt gesehen hat sind Diskussionen zu diesem Thema recht heikel und man kann leicht den Faden verlieren, deshalb wäre es super wenn wir es schaffen würden uns auf den roten Faden zu fixieren, also wie man Sterilkulturen erfolgreich betreibt.

Also, ich möchte auch mal erzählen welche Erfahrungen ich mit Sterilkulturen gemacht habe. Ich befinde mich jetzt schon seit einem Jahr in der Erprobungsphase und komme einfach nicht heraus.

Das Ganze mache ich so zu sagen, als Schulprojekt, wir haben ein genial eingerichtetes Labor in dem alles möglich ist wenn Mannuhr genug Zeit hat, also das habe ich mit 2 Schulkollegen gemacht. (Verwendet wurde stets 1/3 MS von Duchefa mit 20g/l Sacherose)

Angefangen haben wir mit der Sterilisation von Samen, die wir dann in Reagenzgläser gegeben haben, die Reagenzgläser wurden dann mit Zellstoffstopfen verschlossen

- Ergebnis - Bei ausreichender Luftfeuchtigkeit bilden sich Sporen in den Stopfen, Kulturen verkeimen innerhalb kürzester Zeit (also Misserfolg)

Dann haben wir gleichzeitig noch Pflanzenteile versucht zu sterilisieren, Sarracenien, Nepenthes, Droseras und Pingus.

Ich kann nur allen abraten, wir hatten 16x25 Petrischalen, die wir mit Pflanzenteilen befüllt haben, und es gab nicht einen einzigen Erfolg. (und wir arbeiten unter Sterilbänken mit Profiausrüstung und nicht mit Kloreiniger und Aquarien (wobei ich es bewundernswert finde dies so zu versuchen, da es ja auch in Spezialliteratur so vorgeschlagen wird))

Also ich werde so etwas unter den gegebenen Umständen nicht mehr versuchen, weil wir damit nur viel Geld und Zeit verschwendet haben, die wir hatten weil wir warten mussten bis die steril gekeimten Samen groß genug waren)

Aus den steril gekeimten Samen sind inzwischen stattliche Pflanzen herangewachsen (Vergleich: gesäten Drosera regias (InVitro: 4cm Blattlänge ExVitro: 0,5 cm Gesamthöhe, es ist einfach unglaublich wie viel besser die Pflanzen InVitro gedeihen)).

Auf einem Nährboden mit 1/3 MS, 20g/l Sacherose, 100% Vitaminstock, und 2mg/l BAP (Vitamine und BAP sterilfiltriert, Rest autolaviert) das ganze in einer Petrischale haben wir einen Kallus erzeugen können:

Kallusaufnahme mit einem Mikroskop Axioskop von Zeiss

(Bild 1)

Leider ist es uns aufgrund fehlendes Pflanzenmaterials und der tollen (ausnahmsweise mal ironisch gemeint) Ferien der Kallus differenziert und derzeit wächst daraus eine schöne Pinguicula X Sethos heran.

Bild Nr. 2 zeit 2 Monate alte Aufnahmen der vorhandenen sterilen Pflanzen, aktuelle liefere ich auf Wunsch gerne ab morgen (wieder Schule nachdem ich für Jugend Forscht und die Bioolympiade 2 Wochen schulbefreit war)

Weitere Erfolge konnten wir leider noch nicht verbuchen, da wir ja nicht nur einen Steckling steril bewurzeln wollen sondern wir gerne Kalluskulturen durchführen würden, dazu muss aber die genaue Hormonkonzentration bekannt sein, bei der das Gewebe als Kallus wächst und sich nicht differenziert, da wir aber zu wenig Pflanzenmaterial haben können wir dies nicht experimentell bestimmen und müssen uns daher auf Angaben anderer Sachkundiger verlassen, nur leider sind diese so extrem unterschiedlich, dass man verzweifeln könnte. Hier unsere Quellen:

Hermann Wistuba

Strassburger- Lehrbuch der Botanik

Pflanzliche Zell- und Gewebekulturen (rot von 1995)

Zell und Gewebekulturen von Toni Lindl

Handbuch der Praktischen Mikrobiologie

www.DSMZ.de (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen; da gibt aus Zellkulturen von Karnivoren)

Das waren unsere verwendeten Quellen, wobei man sagen muss dass keine Quellen das gleiche Sagen, sie variieren bis zum Faktor 100 +/- und das ist einfach zu viel.

Deshalb jetzt ein konkreter Aufruf an alle die Ahnung haben und das hier lesen, ich wäre sehr froh wenn mir jemand eine funktionsfähige Hormonmischung für die Kallusbildung bei Drosera oder Dionea geben könnte, vielen Dank schon mal im Voraus.

Ach, und nicht dass uns da einer ans Bein Pinkelt, wir sind nicht unfähig, auch wenn wir Schüler sind (13. Klasse des Biotechnologischen Gymnasiums in Waldshut).

Wir haben die selbe Versuchsreihe auch mit Karotten gestartet und hatten dort eine Erfolgsquote über 80% und eine Verkeimungsrate von unter 5%. Also es liegt lediglich an den Hormonkonzentrationen, dann können wir in Massenproduktion gehen (wenn wir das wollten)

Also bitte helft mir, sonst müssen wir dumm sterben.

Volker Morath

Bearbeitet 5. März 2006 von Gast

[Stefan]

Hallo Volker,

erst einmal Respekt vor so viel Einsatz und das zumeist in der Freizeit! Leider kann ich Euch mit Hormonkonz. definitiv nicht helfen, weil ich keine Kalluskulturen betreibe. Ich fürchte auch, dass Euch die Profis Ihre Betriebsgeheimnisse wohl nicht unbedingt offenbaren wollen! Auch wenn Euch das erst einmal nicht weiterhilft, ist es vielleicht beser als das große Schweigen!

Grüße

Stefan

[Gast Volker_Morath]

Na ja, Herr Wistuba hat mir schon einen Tipp gegeben, aber der scheint mir doch ein bissel zu simpel, wobei ich mit dieser Konzentration den Kallus von Pinguicula X Sethos bekommen habe (also muss was dran sein). Na ja, das(http://www.dsmz.de/plant_cell_lines/medium/pdf/4X.pdf) empfiehlt DSMZ (und die haben Ahnung mit hunderten von Zelllinien) für Droseras, also werd ich das wohl benutzen, ist ein ganz heißer Tipp.

Wenn es dann klappt, dann werd ich das ganze mal im Taublatt zusammenfassen, alle Quellen, alle Erfahrungen, vielleicht drucken die es ja, mal schauen. Was meint ihr dazu ??

Volker

PS. wenn wir keine Hormonkonzentration bekommen, dann tüfteln wir uns halt unsere eigene aus, ist zwar wahrscheinlich nicht ganz einfach, aber das schaffen wir schon, in nem halben Jahr bin ich eh an der Uni im Biochemie Studium, dann wird das schon...

Bearbeitet 5. März 2006 von Gast

[Gast]

hallo zusammen

ich habe mir vor einer woche mein nährmedium zusammengemixt. Bis jetzt sieht es noch ziemlich steril aus. jetzt müsste ich nur noch genauer wissen wo ich die zellen bei den nepenthes und den heliamphoren entnehmen muss, da ich mir noch nie richtig sicher war. kann mir das jemand sagen ?

[Gast Volker_Morath]

Ich will dich nicht entmutigen, aber ich kann mir beim besten Willen nicht vorstellen dass du das Gewebe steril bekommst und vor allem hast du ja keine Hormonkonzentration, also deine Erfolgschancen tendieren gegen 0

Berichtigt mich ruhig, aber ich würde sagen das geht so nicht.

Volker

Bitte nach dem Schreiben eines Beitrags nicht die "Zurück"-Taste des Browsers benutzen, da es sonst zu Doppel-Einträgen kommt. Danke!

Viele Grüße, Christian

Bearbeitet 8. März 2006 von Gast

[JanW]

Respekt Volker! Bitte berichte uns auch in Zukunft über Deine Experimente. Ich bin leider über die Gedankenexperimentalphase nie heraus gekommen.

Gruß,

Jan

[Denis Barthel]

Hm, mir kommt da grad ein Gedanke, den ich mal zur Diskussion stellen möchte. Wenn man keinen Autoklaven sein eigen nennt, so könnte man gegebenenfalls doch auf einen Sterilisator für Babybedarf ausweichen. Ich bin mir nur nicht sicher, ob man damit den Überdruck erzielen kann, die Frage wäre also, wie zwingend dieser denn ist.

Sollte das funktionieren, so wäre das auf jeden Fall eine günstige Alternative zum Autoklav, denn diese Geräte kosten nur um die 50 Euro.

Grübelnd,

Denis

[Oliver Groß]

Hallo Dennis,

die Idee mit dem Sterilisator für Babybedarf hatte ich auch mal im Auge. Wußte jetzt gar nicht, dass die überhaupt mit einem Druck arbeiten. Arbeiten die nicht nur mit Wärme (Hitze)?

Ich bin dann mehr zu einem Schnellkochtopf übergegangen. Allerdings habe ich es noch nicht versucht, aus zeitlichen Gründen.

Im Orchideen-Forum wird oft berichtet, dass viele es mit dieser Methode handhaben. Einige machen es sogar im Backhofen, was aber dann sicher dem Sterilisator für Babybedarf gleich kommt.

Ciao Oliver

[Gast Martin Rümmler]

Hi,

korrigiert mich, wenn ich falsch liege, aber ich glaube, der Überdruck ist in sofern essentiell, als dass er den Siedepunkt der zu autoklavierenden Medien erhöht. Ansonsten wären Sterilisationstemperaturen von 121 °C nicht zu erreichen.

Grüße,

Martin

Bearbeitet 9. März 2006 von Gast

[Andreas Wistuba]

Exakt.

Du bekommst Flüssigkeiten auch bei niedrigeren Temperaturen keimarm aber eben nicht keinfrei.

Pasteurisieren wird ja auch bei niedrigeren Temperaturen durchgeführt.

Mit Glück kann man so auch Medien erhalten, die sauber bleiben. Man findet in der Literatur auch immer mal wieder Ansätze mit Mikrowellen.

Offengestanden halte ich von all dem nichts. Ein Dampfdrucktopf ist ja keine unbezahlbare Investition und funktioniert tadellos solange die Größe ausreicht.

Viele Grüße

Andreas

[Oliver Groß]

@ Martin,

ja, ich denke auch, dass der Druck von entscheider Rolle ist. Un in einem Schnellkochtopf kann man schon den Druck erreichen, der für 121°C ausreicht.

@ Andreas,

was genau meinst Du jetzt mit "solange die Größe ausreicht"? Muss ein "Mindest-Leer-Raum" im Topf vorhanden sein? Also darf der Topf nicht komplett gefüllt sein, weil sich sonst der Druck nicht bis zu der erforderlichen Höhe aufbauen kann?

Ciao Oliver

[Andreas Wistuba]

@ Andreas,

was genau meinst Du jetzt mit "solange die Größe ausreicht"? Muss ein "Mindest-Leer-Raum" im Topf vorhanden sein? Also darf der Topf nicht komplett gefüllt sein, weil sich sonst der Druck nicht bis zu der erforderlichen Höhe aufbauen kann?

Hallo Oliver,

ich meinte lediglich, daß Dampfdrucktöpfe nicht besonders groß sind. Du wirst wohl schon Probleme haben, eine Literflasche hineinzustellen.

Gruß

Andreas

[Oliver Groß]

Hallo Andreas,

stimmt, so hohe Töpfe sind selten.

Aber ich wollte ja nicht 1 Liter Medium darin steril machen, sondern fülle es ja schon in die Kulturbehälter wie z.B. Petrischalen, Reagenzglässer o. ä. hitzebeständiges Glässer ab und wollte diese dann in den Topf setzen. Und diese sind ja nicht so hoch.

Ciao Oliver

[Denis Barthel]

Offengestanden halte ich von all dem nichts. Ein Dampfdrucktopf ist ja keine unbezahlbare Investition.

Wo du recht hast, hast du recht, dann eben ab ins Haushaltswarengeschäft. War halt nur ne Idee, bevor ich den Sterilisator in ein paar Monaten abgebe.

[Flipp]

Hallo zusammen,

so also meine ersten beiden Versuche der In-Vitro Vermehrung

sind mal in die Hose gegangen.

Beim zweiten Versuch wollte ich es mit MS-Substrat + Vitaminen

von DUCHEFA versuchen. Die Sterilisation über Wasserdampf hatte eigentlich sehr gut geklappt und es hatten sich auch keine Keime gebildet. Ich denke es liegt einfach noch an den fehlenden Beimischungen die die Pflanzenteile zum Wachsen anregen sollen.

Wollte Drosera Profilera und Ne. Lowii durch Blattstücke vermehren.

Hat da vielleicht jemand einen Tipp oder eine Idee.

Nur mit MS + Vitaminen wird das nix.

Gruß

[Gast Volker_Morath]

Was ?? Du hast es geschafft auf einen MS-Agar der Sacharose enthält Pflanzenteile zu setzen die nicht mikrobiell kontaminiert sind ?? Und das auch noch bei Nepenthes und es mangelt nur an den Hormonen, habe ich das richtig verstanden ?? Dann schmeiß ich den s***** den ich gemacht hin, weil mir das noch nie auf Dauer gelungen ist...

oder

Du hast deine Versuche einfach ohne eine Kohlenstoffquelle (Zucker, meist Sacharose z.B. 20g/l)durchgeführt, wenn ja dann würde ich das mal ändern, dann merkst du wohl ganz schnell dass die mikrobielle Kontamination doch ganz schnell zum Problem werden kann.

Bin gespannt mehr zu erfahren.

Volker

PS. Ich glaube auch nicht, dass es ausreicht ein Sterilisationsgerät für Babysachen zu nehmen, das kann ja gar nicht funktionieren, aber ich habe auch schon gelesen, dass mehrmaliges Behandeln des Mediums mit der Mikrowelle bis zum Sieden auch schon reicht um es steril zu bekommen, müsste man im Zweifelsfall einfach mal ausprobieren.

[Fabian Z.]

ganz kleiner Zwischenbericht:

bis jetzt sind 3 von 50 Gläsern kontaminiert (alle drei waren Blatttstücke von D. paradoxa). Bei den restelichen 47 hat sich noch nichts getan (werder Kontamination, noch Keimung)

Gruß

[Fabian Z.]

Mittlerweile hat sich etwas getan... ein paar Samen haben gekeimt und kein anderes Glas ist sichtbar kontaminiert worden. Ich versuche die Woche noch Bilder reinzustellen.

Gruß Fabian

[Gast Volker_Morath]

Hau rein, ich habe noch mal nen Versuch mit Kalluskulturen gestartet, das gibt es danna auch in 2 Wochen wenns ABI rum ist.

Volker

[Fabian Z.]

Hallo...endlich mal wieder ein Update:

alle verbleibenden 47 Gläser sind, entgegen allen Zweiflern, noch steril. Allerdings habe ich das Problem, dass die meisten Samen immer noch nicht gekeimt sind (vielleicht zu stark desinfiziert?). Auch bei den verbleibenden Pflanzenteilen hat sich noch nichts getan. Nur die D. intermedia 'Brazil' und die D. regia sind fleißig am wachsen. Anbei zwei Bilder.

Wie lange soll ich die Pflanzchen in-vitro lassen?

@ Volker: du bist uns auch noch ein Update schuldig

@ all: Habe noch viel zu viel Zutaten fürs Medium. Wer sich auch mal in Sterilbankkulturen versuchen möchte, dem könnte ich was abgeben(einfach per E-Mail melden). Am liebsten Tausch gegen Pflanzen und/oder Samen

Bearbeitet 23. April 2006 von Gast