Manuel Reimansteiner 1,123 Posted November 23, 2013 (edited) Hallo, hier werde ich in nächster Zeit eine Anleitung zur In Vitro - Kultur erstellen. ALLGEMEINES: (auf pflanzliche In Vitro Kultur bezogen)Die In Vitro - Kultur (im Glas), im englischen auch als Tissue Culture bezeichnet, beschreibt die vielfachen Methoden Pflanzen unter sterilen Bedingungen und unter dem Einfluss von wuchsspezifischen Phytohormonen zu kultivieren und vermehren.1.1 Pflanzenhormone: (Phytohormone) Diese werden eigens von der Pflanze in geringen Mengen produziert (z.B. Gibberelline, Auxine, Cytokinine, [Ethylen, Abscisinsäure], ...). Sie haben die Aufgabe, den Pflanzenwuchs in die richtige Richtung zu lenken. Diese Erkenntnis macht man sich IV (In Vitro) zu Nutze um z.B. Wurzelbildung, Kallusbildung oder Sprossbildung an der Pflanze bzw. an Zellen hervorzurufen. Phytohormone werden in 2 Bereiche eingeteilt: Wachstumsfördernde Phytohormone: Auxine, Cytokinine, Gibberelline Wachstumshemmende Phytohormone: Abscisine, Ethylen Hier eine kleine Auflistung an wachstumsfördernden Phytohormonen:1.1.1 AUXINE: IES=IAA, Indolylessigsäure z.B. Seradix IBS=IBA, Beta-Indolylbuttersäure z.B. Rhizopon NES=NAA, Naphtylessigsäure z.B. Wurzelfix 2,4D, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure; (Herbizid) PAA, Phenylessigsäure CPA, Chlorphenoxyessigsäure Wirkung der Auxine: fördern Zellstreckung/-teilung Apikaldominanz fördert Phototropismus sowie Gravitropismus (versch. Pflanzenbewegungen) Kambiumbildung Frucht-, Blatt-, Wurzelwachstum NAA IAA IBA 1.1.2 GIBBERELLINE: GSx=GAx, Gibberellinsäure CCC, Chlorcholinchlorid Wirkung der Gibberelline: fördern Stoffwechselaktivität fördern Transpiration Hemmung sowie Abbau der Auxine Zellstreckung --> längere Internodien (Blattabstände) längere, schmale Blätter Samenkeimung Austreiben von Knospen Blütenbildung Parthenokarpie (Entwicklung von Früchten ohne vorheriger Befruchtung) Einleitung von Ruheperioden 1.1.3 CYTOKININE: TDZ, Thidiazuron BA, Benzyladenin BAP, Benzylaminopurine KINETIN, Kinetin Z, Zeatin ZR, Zeatinriboside iP, Isopentenyladenine iPA, Isopentenyladenosine Wirkung der Cytokinine: Förderung der RNS (Ribonukleinsäure, ähnlich DNA) und Proteinsynthese Zellteilung Apikaldominanz Samenkeimung erhöhen Stress-Resistenz Verzögerung von Alterungsvorgängen Sprossbildung Kinetin 6-BAP Auf wachstumshemmenden Phytohormonen möchte ich hier nicht näher eingehen, da sie nur wenig Bedeutung für die IV-Kultur haben. Für nachfolgende Erklärungen verwende ich immer die Abkürzungen der Pflanzenhormone. 1.2 Nährmedium: Das Nährmedium hat für die IV – Kultur die Aufgabe, Pflanzenteile (Meristeme, Saatgut, …) sowie einzelne Zellen mit Hilfe von Makro-/Mikronähstoffe unter der Beimischung von einer Kohlenstoffquelle, meist in Form von Saccharose, am Leben zu erhalten sowie zum Wachsen zu bringen. krautige Pflanzen: MS (Murashige & Skoog), Knudson C, … Gehölze: WPM (Woddy Plant Media) Für die Kultivierung von Karnivoren verwendet man ausschließlich das für krautige Pflanzen. Bei der Aussat dürfen, bis auf wenige Ausnahmen, keine Hormone im Nährmedium enthalten sein, da es sonst zu Mutationen, Fehlbildungen oder keinen lebensfähigen Pflanzen kommen kann. Im Nährmedium sind neben Vitaminen, (Hormonen), Geliermittel auch noch Makro-/Mikronährstoffe enthalten. Makronährstoffe: C, O, N, P, H, Mg, Ca, S Mikronährstoffe: Fe, Mn, Zn, Cu, Ni, Cl Mischen des Mediums mit Hilfe eines Magnetrührers 1.2.1 Geliermittel: ... haben die Aufgabe das flüssige Medium zu verfestigen. Agar: (aus Rotalgen hergestelltes Quellmittel), je nach Reinheit zw. 5-8 g/L Medium Gelzan, Gelrite, Phytagel: (ein Mittels biotechnologischen Verfahren hergestelltes Quellmittel aus dem Bakterienstamm der Pseudomonas) je nach Reinheit zw. 2-3 g/L Medium Agar bekommt heutzutage in jedem Reformhaus, hochwertige Formen davon bei Sigma-Aldrich oder Duchefa. Macht ein trübig, weißes Nährmedium. Gelrite gibt es nur bei den oben genannten Shops. Macht ein glasklares Medium, gut geeignet für die schnelle Identifizierung von Kontaminationen. Außerdem können und werden Medien, die mit bestimmten Pflanzenhormonen versehen sind, eingefärbt. TDZ, NAA - Medium, rot eingefärbt 1.3 Sterilisation: Einer der wichtigsten Faktoren für die erfolgreiche IV-Kultur ist das sterile Arbeiten, sowie die Sterilisation. Sowohl die Umgebung, als auch die Pflanzenteile (Zellen, Meristem, Saatgut) müssen vor dem Aufbringen auf das Medium sterilisiert (keimfrei) gemacht werden. Sterilisation von Medien und Kulturgefäßen: im Autoklaven bei 121 Grad Celsius und 2 bar Überdruck, für eine Zeit von 15-25 Minuten, je nach der zu sterilisierenden Menge. (Achtung: gewisse Phytohormone und Nährstoffe zersetzen sich bei diesen Temperaturen und müssen deshalb sterilfiltriert werden!) Backrohr: Sterilisation bei 150 Grad Celsius, für eine Zeit von 20-30 Minuten. Nur für Glaßbehälter geeignet! Druckkochtopf: ähnlich Autoklaven, nur weniger Fassungsvermögen. Gefäße und Medien nach erfolgreicher Sterilisation Sterilisation von Pflanzenteilen: Je nach Größe und Gewebestruktur müssen unterschiedliche Sterilisationen erprobt werden! NaDCC – Lösung: hauptsächlich für widerstandsfähiges, hartes Saatgut, z.B. Dionaea PPM (Plant Preservative Mixture) – Lösung: ein Bioreaktor welcher Kontaminationen sowohl an Pflanzenteilen als auch in Medien (meistens 1 ml/L Medium) vorbeugt. Wird hauptsächlich für die Sterilisation von Nepenthes – Samen verwendet. H2O2 – Wasserstoffperoxid Tween Danchlor: sowohl Samen als auch Pflanzen in variierenden Konzentrationen 1.4 Kulturgefäße:Als Kulturgefäße können alle dicht verschließbare Gefäße aus Kunststoff (PP, Polypropylen!!) oder Glas verwendet werden. Für manche Gattungen und Arten benötigt man neben den Gefäßen noch einen HEPA - Filter, um einen Gasaustausch zu gewährleisten. (Combiness) Gefäße mit HEPA - Filter Detailaufnahme des Filters Final Product, N. alba frisch EV ...und D. ultramafica, kurz nach dem öffnen Für genaue Hormonkonzentrationen und weiteren Fragen stehe ich gerne per PN zu Verfügung Ich hoffe ich konnte euch einen kleinen Einblick in diese Kulturform geben. Viele Grüße, Manuel Neuigkeiten werden immer in diesem Post aktualisiert. Edited June 13, 2015 by Manuel Reimansteiner 20 1 Quote Share this post Link to post Share on other sites
Felix S 167 Posted November 23, 2013 (edited) Hi Manuel, Super Doku, danke für die erste Einführung in die In Vitro -Kultur !Gehört meiner Meinung nach zu den Lesenswerten Artikeln! Ich freu mich schon auf die angekündigte genauere Anleitung Jetzt seht meinen ersten In Vitro Versuchen nichts mehr im Wege Felix Edited November 23, 2013 by Felix S Quote Share this post Link to post Share on other sites
Berni Toller 573 Posted November 24, 2013 Manche säen sogar noch normal aus, hab ich zumindest gehört... 2 Quote Share this post Link to post Share on other sites
Andreas Wistuba 1,712 Posted November 24, 2013 Manche säen sogar noch normal aus, hab ich zumindest gehört... Echt? Kann ich mir nicht vorstellen Grüße Andreas 2 Quote Share this post Link to post Share on other sites
HansHansen 84 Posted November 24, 2013 Vielen Dank Manuel, ein interessanter Einblick in die in Vitro-Kultur. Ich finde es ja besser wenn Pflanzen in Vitro vermehrt und in Verkehr gebracht werden, als wenn einer in z.b. Borneo oder Sumatra in der Natur Samen Raub betreibt. Ich würde mich freuen wenn dieses Thema nicht lächerlich gemacht wird und ich noch vieles Interessantes hier lesen darf. Gruß Hans 1 Quote Share this post Link to post Share on other sites
Manuel Reimansteiner 1,123 Posted November 24, 2013 Update: Bilder oben eingefügt 1 Quote Share this post Link to post Share on other sites
Manuel Reimansteiner 1,123 Posted November 24, 2013 Hallo, Vielen Dank für die viele positive Resonanz! :-) @Felix: Danke. Das Toturial folgt in 2 bis 3 Wochen. @Berni: bei der Klonvermehrung kommst du mit Samen nicht weit... @Hans: Vielen Dank! Ich finde es ja besser wenn Pflanzen in Vitro vermehrt und in Verkehr gebracht werden, als wenn einer in z.b. Borneo oder Sumatra in der Natur Samen Raub betreibt. Genau das ist mein Ziel. Ohne IV - Kultur könnten keine Dionaea für 4€ im Baumarkt angeboten werden. Sie wären längst alle am Naturstandort verschwunden. @Wolfgang: Man kann selbst mit sehr einfachen Mitteln eine sterile Umgebung erzeugen. Mit umgedrehten Aquarien, Kästen und etwas Ethanol kann man schon ganz schön viel anstellen. Quote Share this post Link to post Share on other sites
Kevin G. 168 Posted November 24, 2013 Hallo Manuel, Wirklich eine tolle Einführung in die IV-Kultur. Hut ab! Gruß Kevin Quote Share this post Link to post Share on other sites
Andreas Wistuba 1,712 Posted November 24, 2013 (edited) ...Ich würde mich freuen wenn dieses Thema nicht lächerlich gemacht wird... Sorry wenn mein etwas flapsiger Kommentar, der einzig eine Antwort auf Bernis Einwand war, so zu verstehen war. Ich bin ein Verfechter und beruflicher Anwender der IV-Kultur und begrüße es, wenn das Thema in diesem Thread etwas "entmystifiziert" wird. Grüße Andreas Edited November 24, 2013 by Andreas Wistuba 2 Quote Share this post Link to post Share on other sites
Jan Z. 161 Posted November 24, 2013 Guten Abend, sehr interessant! Gerne mehr. Mit freundlichen Grüßen, Jan. Quote Share this post Link to post Share on other sites
Manuel Reimansteiner 1,123 Posted November 24, 2013 Hallo Wolfgang, ich verstehe dich voll und ganz, da ich ja irgendwie das Problem auch kenne. Mit der Zeit spezialisiert man sich ja auch. Viele Grüße, Manuel Quote Share this post Link to post Share on other sites
toby 26 Posted November 25, 2013 Hi, sehr gute Doku. Verständlich geschrieben und äußerst informativ. Weiter so. Gruß Toby Quote Share this post Link to post Share on other sites
Manuel Reimansteiner 1,123 Posted November 26, 2013 Hallo Toby, auch an dich ein "Danke", selbstverständlich werde ich weiter berichten. Viele Grüße, Manuel Quote Share this post Link to post Share on other sites
Manuel Reimansteiner 1,123 Posted January 28, 2014 (edited) Hallo, hier noch ein Bild einer frisch umgelegten Bromelienkultur. In diesem Sinne, Danke an Felix für das Saatgut. Viele Grüße, Manuel PS: Bild zur Färbung von Medien eingefügt Edited January 28, 2014 by Manuel R. 3 Quote Share this post Link to post Share on other sites
Manuel Reimansteiner 1,123 Posted February 18, 2014 (edited) Hallo, hier noch einige Impressionen von IV-Kulturen um zu vermeiden, dass die Orchideenfreunde zu kurz kommen. Cattleya guttata Phalaenopsis bellina Phalaenopsis lueddemanniana x mannii Phalaenopsis equestris Dionaea muscipula - sich ausdifferenzierender Kallus Doritaenopsis 'Pride' Phalaenopsis amboinensis typ sinaensis Phalaenopsis gigantea Phalaenopsis fimbriata x violacea 'Malaysia' Sarracenia spec./hybrids Aechmea fasciata Viele Grüße, Manuel Edited February 18, 2014 by Manuel R. 8 Quote Share this post Link to post Share on other sites
Tobias.Z 30 Posted November 20, 2017 Sehr interessant ich habe mir die letzte Zeit viele in vitro nephentes gekauft. Und nun hat mich der Wissenhunger gepackt wie das alles abläuft von Anfang bis man sie bekommt etc. Ich hoffe es kommt bald mal ein Update. Evt werde ich mich dort auch mal heranwagen wenn man nicht gleich tausende Euro los ist. MfG Tobias Quote Share this post Link to post Share on other sites
Manuel Reimansteiner 1,123 Posted November 20, 2017 vor 16 Minuten schrieb Schlauchi: Sehr interessant ich habe mir die letzte Zeit viele in vitro nephentes gekauft. Und nun hat mich der Wissenhunger gepackt wie das alles abläuft von Anfang bis man sie bekommt etc. Ich hoffe es kommt bald mal ein Update. Evt werde ich mich dort auch mal heranwagen wenn man nicht gleich tausende Euro los ist. MfG Tobias Hallo Tobias, mittlerweile hat sich doch einiges getan. Hier habe ich letztes Jahr noch einen Thread erstellt - etwas aktueller. Viele Grüße Manuel 1 1 Quote Share this post Link to post Share on other sites
