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Manuel Reimansteiner

In Vitro - Kultur

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Manuel Reimansteiner

Hallo,

hier werde ich in nächster Zeit eine Anleitung zur In Vitro - Kultur erstellen.

  • ALLGEMEINES: (auf pflanzliche In Vitro Kultur bezogen)
Die In Vitro - Kultur (im Glas), im englischen auch als Tissue Culture bezeichnet, beschreibt die vielfachen Methoden Pflanzen unter sterilen Bedingungen und unter dem Einfluss von wuchsspezifischen Phytohormonen zu kultivieren und vermehren.

1.1 Pflanzenhormone: (Phytohormone)

Diese werden eigens von der Pflanze in geringen Mengen produziert (z.B. Gibberelline, Auxine, Cytokinine, [Ethylen, Abscisinsäure], ...). Sie haben die Aufgabe, den Pflanzenwuchs in die richtige Richtung zu lenken. Diese Erkenntnis macht man sich IV (In Vitro) zu Nutze um z.B. Wurzelbildung, Kallusbildung oder Sprossbildung an der Pflanze bzw. an Zellen hervorzurufen.

Phytohormone werden in 2 Bereiche eingeteilt:

  • Wachstumsfördernde Phytohormone: Auxine, Cytokinine, Gibberelline
  • Wachstumshemmende Phytohormone: Abscisine, Ethylen
Hier eine kleine Auflistung an wachstumsfördernden Phytohormonen:

1.1.1 AUXINE:

  • IES=IAA, Indolylessigsäure z.B. Seradix
  • IBS=IBA, Beta-Indolylbuttersäure z.B. Rhizopon
  • NES=NAA, Naphtylessigsäure z.B. Wurzelfix
  • 2,4D, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure; (Herbizid)
  • PAA, Phenylessigsäure
  • CPA, Chlorphenoxyessigsäure
Wirkung der Auxine:
  • fördern Zellstreckung/-teilung
  • Apikaldominanz
  • fördert Phototropismus sowie Gravitropismus (versch. Pflanzenbewegungen)
  • Kambiumbildung
  • Frucht-, Blatt-, Wurzelwachstum
NAA

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IAA

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IBA

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1.1.2 GIBBERELLINE:

  • GSx=GAx, Gibberellinsäure
  • CCC, Chlorcholinchlorid
Wirkung der Gibberelline:
  • fördern Stoffwechselaktivität
  • fördern Transpiration
  • Hemmung sowie Abbau der Auxine
  • Zellstreckung --> längere Internodien (Blattabstände)
  • längere, schmale Blätter
  • Samenkeimung
  • Austreiben von Knospen
  • Blütenbildung
  • Parthenokarpie (Entwicklung von Früchten ohne vorheriger Befruchtung)
  • Einleitung von Ruheperioden
1.1.3 CYTOKININE:
  • TDZ, Thidiazuron
  • BA, Benzyladenin
  • BAP, Benzylaminopurine
  • KINETIN, Kinetin
  • Z, Zeatin
  • ZR, Zeatinriboside
  • iP, Isopentenyladenine
  • iPA, Isopentenyladenosine
Wirkung der Cytokinine:
  • Förderung der RNS (Ribonukleinsäure, ähnlich DNA) und Proteinsynthese
  • Zellteilung
  • Apikaldominanz
  • Samenkeimung
  • erhöhen Stress-Resistenz
  • Verzögerung von Alterungsvorgängen
  • Sprossbildung
Kinetin

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6-BAP

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Auf wachstumshemmenden Phytohormonen möchte ich hier nicht näher eingehen, da sie nur wenig Bedeutung für die IV-Kultur haben.

Für nachfolgende Erklärungen verwende ich immer die Abkürzungen der Pflanzenhormone.

1.2 Nährmedium:

Das Nährmedium hat für die IV – Kultur die Aufgabe, Pflanzenteile (Meristeme, Saatgut, …) sowie einzelne Zellen mit Hilfe von Makro-/Mikronähstoffe unter der Beimischung von einer Kohlenstoffquelle, meist in Form von Saccharose, am Leben zu erhalten sowie zum Wachsen zu bringen.

krautige Pflanzen: MS (Murashige & Skoog), Knudson C, …

Gehölze: WPM (Woddy Plant Media)

Für die Kultivierung von Karnivoren verwendet man ausschließlich das für krautige Pflanzen.

Bei der Aussat dürfen, bis auf wenige Ausnahmen, keine Hormone im Nährmedium enthalten sein, da es sonst zu Mutationen, Fehlbildungen oder keinen lebensfähigen Pflanzen kommen kann.

Im Nährmedium sind neben Vitaminen, (Hormonen), Geliermittel auch noch Makro-/Mikronährstoffe enthalten.

Makronährstoffe: C, O, N, P, H, Mg, Ca, S

Mikronährstoffe: Fe, Mn, Zn, Cu, Ni, Cl

Mischen des Mediums mit Hilfe eines Magnetrührers

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1.2.1 Geliermittel:

... haben die Aufgabe das flüssige Medium zu verfestigen.

Agar: (aus Rotalgen hergestelltes Quellmittel), je nach Reinheit zw. 5-8 g/L Medium

Gelzan, Gelrite, Phytagel: (ein Mittels biotechnologischen Verfahren hergestelltes Quellmittel aus dem Bakterienstamm der Pseudomonas) je nach Reinheit zw. 2-3 g/L Medium

Agar bekommt heutzutage in jedem Reformhaus, hochwertige Formen davon bei Sigma-Aldrich oder Duchefa. Macht ein trübig, weißes Nährmedium.

Gelrite gibt es nur bei den oben genannten Shops. Macht ein glasklares Medium, gut geeignet für die schnelle Identifizierung von Kontaminationen.

Außerdem können und werden Medien, die mit bestimmten Pflanzenhormonen versehen sind, eingefärbt.

TDZ, NAA - Medium, rot eingefärbt

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1.3 Sterilisation:

Einer der wichtigsten Faktoren für die erfolgreiche IV-Kultur ist das sterile Arbeiten, sowie die Sterilisation. Sowohl die Umgebung, als auch die Pflanzenteile (Zellen, Meristem, Saatgut) müssen vor dem Aufbringen auf das Medium sterilisiert (keimfrei) gemacht werden.

Sterilisation von Medien und Kulturgefäßen:

  • im Autoklaven bei 121 Grad Celsius und 2 bar Überdruck, für eine Zeit von 15-25 Minuten, je nach der zu sterilisierenden Menge. (Achtung: gewisse Phytohormone und Nährstoffe zersetzen sich bei diesen Temperaturen und müssen deshalb sterilfiltriert werden!)
  • Backrohr: Sterilisation bei 150 Grad Celsius, für eine Zeit von 20-30 Minuten. Nur für Glaßbehälter geeignet!
  • Druckkochtopf: ähnlich Autoklaven, nur weniger Fassungsvermögen.
Gefäße und Medien nach erfolgreicher Sterilisation

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Sterilisation von Pflanzenteilen:

Je nach Größe und Gewebestruktur müssen unterschiedliche Sterilisationen erprobt werden!

  • NaDCC – Lösung: hauptsächlich für widerstandsfähiges, hartes Saatgut, z.B. Dionaea
  • PPM (Plant Preservative Mixture) – Lösung: ein Bioreaktor welcher Kontaminationen sowohl an Pflanzenteilen als auch in Medien (meistens 1 ml/L Medium) vorbeugt. Wird hauptsächlich für die Sterilisation von Nepenthes – Samen verwendet.
  • H2O2 – Wasserstoffperoxid
  • Tween
  • Danchlor: sowohl Samen als auch Pflanzen in variierenden Konzentrationen
1.4 Kulturgefäße:

Als Kulturgefäße können alle dicht verschließbare Gefäße aus Kunststoff (PP, Polypropylen!!) oder Glas verwendet werden.

Für manche Gattungen und Arten benötigt man neben den Gefäßen noch einen HEPA - Filter, um einen Gasaustausch zu gewährleisten. (Combiness)

Gefäße mit HEPA - Filter

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Detailaufnahme des Filters

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Final Product, N. alba frisch EV

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...und D. ultramafica, kurz nach dem öffnen

Für genaue Hormonkonzentrationen und weiteren Fragen stehe ich gerne per PN zu Verfügung

Ich hoffe ich konnte euch einen kleinen Einblick in diese Kulturform geben.

Viele Grüße,

Manuel

Neuigkeiten werden immer in diesem Post aktualisiert.

Edited by Manuel Reimansteiner
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Felix S

Hi Manuel,

Super Doku, danke für die erste Einführung in die In Vitro -Kultur !Gehört meiner Meinung nach zu den Lesenswerten Artikeln!

Ich freu mich schon auf die angekündigte genauere Anleitung

Jetzt seht meinen ersten In Vitro Versuchen nichts mehr im Wege  ;)

 

Felix

Edited by Felix S

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Berni Toller

Manche säen sogar noch normal aus, hab ich zumindest gehört...

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Andreas Wistuba

Manche säen sogar noch normal aus, hab ich zumindest gehört...

 

Echt?

Kann ich mir nicht vorstellen ;)

Grüße

Andreas

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HansHansen
Vielen Dank Manuel,

 

ein interessanter Einblick in die in Vitro-Kultur.

 

Ich finde es ja besser wenn Pflanzen in Vitro vermehrt und in Verkehr gebracht werden,

als wenn einer in z.b. Borneo oder Sumatra in der Natur Samen Raub betreibt.

 

Ich würde mich freuen wenn dieses Thema nicht lächerlich gemacht wird und ich noch vieles

Interessantes hier lesen darf.

 

Gruß

Hans

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Manuel Reimansteiner

Update: Bilder oben eingefügt

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Manuel Reimansteiner

Hallo,

 

Vielen Dank für die viele positive Resonanz! :-)

 

@Felix: Danke. Das Toturial folgt in 2 bis 3 Wochen.

 

@Berni: bei der Klonvermehrung kommst du mit Samen nicht weit... ;)

 

@Hans: Vielen Dank!

 

Ich finde es ja besser wenn Pflanzen in Vitro vermehrt und in Verkehr gebracht werden,
als wenn einer in z.b. Borneo oder Sumatra in der Natur Samen Raub betreibt.

 

Genau das ist mein Ziel. Ohne IV - Kultur könnten keine Dionaea für 4€ im Baumarkt angeboten werden. Sie wären längst alle am  Naturstandort verschwunden.

 

@Wolfgang: Man kann selbst mit sehr einfachen Mitteln eine sterile Umgebung erzeugen. Mit umgedrehten Aquarien, Kästen und etwas Ethanol kann man schon ganz schön viel anstellen.

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Kevin G.

Hallo Manuel,

 

Wirklich eine tolle Einführung in die IV-Kultur. Hut ab! :)

 

Gruß

Kevin

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Andreas Wistuba

...Ich würde mich freuen wenn dieses Thema nicht lächerlich gemacht wird...

 

Sorry wenn mein etwas flapsiger Kommentar, der einzig eine Antwort auf Bernis Einwand war, so zu verstehen war. 

Ich bin ein Verfechter und beruflicher Anwender der IV-Kultur und begrüße es, wenn das Thema in diesem Thread etwas "entmystifiziert" wird.

Grüße

Andreas

Edited by Andreas Wistuba
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Jan Z.

Guten Abend,

sehr interessant! Gerne mehr.

Mit freundlichen Grüßen,

Jan.

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Manuel Reimansteiner

Hallo Wolfgang,

ich verstehe dich voll und ganz, da ich ja irgendwie das Problem auch kenne. ;)

Mit der Zeit spezialisiert man sich ja auch.

Viele Grüße,

Manuel

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toby

Hi,

 

sehr gute Doku.

 

Verständlich geschrieben und äußerst informativ. Weiter so.

 

Gruß Toby

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Manuel Reimansteiner

Hallo Toby,

auch an dich ein "Danke", selbstverständlich werde ich weiter berichten.

Viele Grüße,

Manuel

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Manuel Reimansteiner

Hallo,

hier noch ein Bild einer frisch umgelegten Bromelienkultur. In diesem Sinne, Danke an Felix für das Saatgut.

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Viele Grüße,

Manuel

PS: Bild zur Färbung von Medien eingefügt

Edited by Manuel R.
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Manuel Reimansteiner

Hallo,

hier noch einige Impressionen von IV-Kulturen um zu vermeiden, dass die Orchideenfreunde zu kurz kommen. ;)

Cattleya guttata

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Phalaenopsis bellina

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Phalaenopsis lueddemanniana x mannii

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Phalaenopsis equestris

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Dionaea muscipula - sich ausdifferenzierender Kallus

post-3407-0-78558600-1392747082_thumb.jp

Doritaenopsis 'Pride'

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Phalaenopsis amboinensis typ sinaensis

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Phalaenopsis gigantea

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Phalaenopsis fimbriata x violacea 'Malaysia'

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Sarracenia spec./hybrids

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Aechmea fasciata

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Viele Grüße,

Manuel

Edited by Manuel R.
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Tobias.Z

Sehr interessant ich habe mir die letzte Zeit viele in vitro nephentes gekauft. Und nun hat mich der Wissenhunger gepackt wie das alles abläuft von Anfang bis man sie bekommt etc. Ich hoffe es kommt bald mal ein Update.

Evt werde ich mich dort auch mal heranwagen wenn man nicht gleich tausende Euro los ist.

MfG Tobias 

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Manuel Reimansteiner
vor 16 Minuten schrieb Schlauchi:

Sehr interessant ich habe mir die letzte Zeit viele in vitro nephentes gekauft. Und nun hat mich der Wissenhunger gepackt wie das alles abläuft von Anfang bis man sie bekommt etc. Ich hoffe es kommt bald mal ein Update.

Evt werde ich mich dort auch mal heranwagen wenn man nicht gleich tausende Euro los ist.

MfG Tobias 

 

Hallo Tobias,

 

mittlerweile hat sich doch einiges getan.

Hier habe ich letztes Jahr noch einen Thread erstellt - etwas aktueller. ;)

 

Viele Grüße

Manuel

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