Invitro im Hobbybereich

[Tobias Kulig]

Hallo,

hier mal ein kleines Update von D. hirticalyx (Bild 1), die ihre Größe seit dem letzten Bild verdoppelt hat. Die Wurzeln dieser Winzlinge haben jetzt auch schon eine gute Länge. Jetzt wird die Größe der Sämlinge schnell zunehmen.

 

Mein besonderer Stolz gilt den Sämlingen von P. planifolia. Ich hatte vorher noch nie Pings im Glas! Es waren jetzt letztendlich doch nur 4 Sämlinge, aber die reichen mir, um sie später in entsprechende Phytohormone umzusetzen, um sie zu vermehren. 
 

Gruß

Tobias

[Tobias Kulig]

Hallo,

hier mal ein kleines Update über meine P. planifolia. Die Größe hat sich inzwischen vervierfacht (ungefähr)! Und so wie es aussieht, hab ich mit meiner Mediumzusammensetzung voll ins Schwarze getroffen. Die Pflänzchen bilden nun sehr kräftige Blätter und auch Wurzeln. 
Es sind auch noch zwei weitere Samen nachträglich aufgegangen, die sich aber relativ nah bei den größeren Pflänzchen befinden und bald verdeckt werden. Das bedeutet, ich muß sie bald umsetzen.
Ich bin grad am Überlegen, ob ich bereits jetzt eine Medium-Charge mit nem Schuß BAP oder Kinetin mache, damit sich die Pflänzchen potenzieren. Oder ob ich noch warte, bis sie deutlich größer sind (eine Pflanze pro Glas). Ich muß das aber genau durchdenken, da ich hier nur wenig Erfahrung habe! Werd ich aber schon irgendwie hinkriegen….Ich halt Euch auf dem Laufenden

 

Gruß

Tobias

[Tobias Kulig]

Hallo,

da ich gerade an meiner LFH den H14 Filter gewechselt habe, nutze ich die Gelegenheit, Euch zu zeigen, wie diese im Inneren aussieht.

 

Bild 1: hier sehr Ihr den neuen Filter, wie er innen montiert und zum Luftaustritt nach vorne mit Moosgummistreifen abgedichtet ist. Mit den seitlichen Holzleisten kann man den Filter schön nach vorne an die Wand ziehen. Funktioniert ausgezeichnet. Dies ist nach vielen Jahren mein erster Filterwechsel! 

 

Bild 2: Der Radiallüfter. Dieser zieht von oben die normale Raumluft durch den Vorfilter (auch neu) und drückt diese dann in der unteren Kammer durch den Hepafilter. Die optimale Strömungsgeschwindigkeit sollte ca. 5m/sec betragen, wobei ich diese aber nie gemessen habe. Wenn man vor dem Arbeitsbereich sitzt und einen guten Luftstrom spürt, sollte es ausreichend sein. 
 

Morgen zerlege ich meinen Autoklav und warte ihn. Dabei werden alle Wasserleitungen gespült, die Elektronik geprüft (vom Schwiegervater) und alles gereinigt. Ich versuche es zu dokumentieren und hier zu zeigen.

 

Beste Grüße

Tobias

Bearbeitet 27. Juni 2023 von Tobias Kulig

[Tobias Kulig]

Hallo,

hier nochmal ein Update über die P. planifolia. Nach weiteren 3,5 Wochen bin ich jetzt wirklich erstaunt, wie die Pflanzen zulegen (schaut mal die Wurzeln an). Ich bin das gar nicht gewohnt, da ich ja vorher nie Pinguicula im Glas hatte. Meine Drosera wachsen ja auch gut, aber die Pings schlagen das um Längen!

Das Dumme ist, ich muß jetzt eine ganze Charge mit Phytohormonen machen, nur wegen 2-3 Gläsern. Ich kann den Rest momentan gar nicht brauchen, da es eine ganz andere Medienzusammensetzung ist, als die meiner Drosera. Ich werde die Dosierungen vierteln müssen, um nacher nicht zuviel Gläser rumstehen zu haben. Denn Phytohormone lassen sich in fertigen Gläsern nicht lange lagern.

 

Weitere Updates folgen…

 

Beste Grüße

Tobias

 

[partisanengärtner]

Kann man das nicht in der Gefriere länger lagern?

[Tobias Kulig]

Grüß Dich Axel,

Phytohormone kann man durchaus einfrieren, das ist kein Problem. Das ist ja auch der momentane Aggregatszustand. Ich hab vor einigen Jahren 6-BAP und Kinetin portionsweise (0,2ml) gelöst und sofort eingefroren. Hält fast ewig.

 

Das Problem bei der eingemischten Form in einem Nährmedium sind die Temperaturwechsel. Da besteht die Gefahr einer ungewollten Ansaugung der Raumluft, was eine Kontamination hervorrufen würde. Zudem benutze ich Gläser, die würden sicher platzen. Aber auch selbst bei PP-Bechern wäre mir das zu riskant. Wäre vielleicht auch interessant als nachträgliche Stratifikation.

 

Richtig eingefuchste IV Freaks kennen bestimmt auch da Tricks, die kenne ich allerdings (noch) nicht.

 

Grüße

Tobias

[Oli C.]

Hallo zusammen,

 

es ist echt toll, dass ihr euch hier im Forum auch über InVitro Kultivierung bzw. Gewebekultur unterhaltet. Zwar bin ich in Sachen Karnivoren praktisch noch ein Neuling, aber mit InVitro unter'm eigenen Dach konnte ich schon einige Erfahrungen sammeln. Einer Sache möchte ich Tobias vorab aber widersprechen: Es geht auch ohne Laminar Flow Hood!

 

Aber das kann aufwändig werden und HEPA Filter in handlicher Größe sind bezahlbar. Die kosten meistens weniger als manche Nepenthes...

 

Ich habe mich besonders in englischsprachigen Foren zu dem Thema umgeguckt. Das ist jedem ja frei zugänglich, ohne sich anmelden zu müssen. Besonders in der Kultur von Pflanzen und Pilzen, die nicht gerade legal sind, scheint InVitro Kultur weit verbreitet zu sein. In diesem Themengebiet konnte ich in diesen Foren einiges lernen. Die Illegalität scheint hier erfinderisch gemacht zu haben. 

 

Ich benutze selbst auch einen Schnellkochtopf als Autoklave und da Schnellkochtöpfe unter Druck auch auf 120°C kommen, sind es auch eigentlich normale Autoklaven. Für mich funktioniert das super.

 

Ich benutze Gefäße vollkommen aus PP, die für Lebensmittel usw. gedacht sind. Sogenannte deli container oder ähnliches. Diese schließen sehr gut. Ich brenne in die Deckel immer zwei Löcher und verklebe eines mit 3 Lagen Micropore 3M Klebeband und auf das andere komm ein self healing plug. (Also ein selbstheilender Stopfen).

Wozu das ganze? Das Micropore ist verblüffender Weise ziemlich beständig und hält Verunreinigungen ab. Ich hab mehrere Versuche mit Medien gemacht, die für Bakterien ausgelegt sind, ohne sie zu inokulieren und die Medien blieben über Wochen mit dem zugeklebten Loch steril. Das tolle daran ist aber, dass jetzt ein Druckausgleich mögich ist und ich die Behälter geschlossen in den Schnellkochtopf stellen kann und beim herausnehmen nichts mehr verunreinigen kann, weil sie eben schon zu sind. 

 

Diese self healing plugs also Gummistopfen habe ich anfänglich dafür verwendet, nach dem Autoklavieren die Phytohormone durch einen 0.22uM Spritzenfilter und einer Nadel in das Medium zu geben und mit abgeflammter Nadel gab es auch hier keine Verunreinigungen. Jedoch werden in zahlreichen Papers und Protokollen eigentlich alle Phytohormone mit autoklaviert. Ausnahmen sind hier wohl Gibberelline und Oryzalin. Beide habe ich noch nicht verwendet, aber die würde ich dann mit so einem Spritzenfilter hinzufügen.

 

Und wie mache ich den Rest, wenn nicht in einer LFH? In einer SAB (still air box - "ruhige Luftbox").

 

Der Gedanke dahinter ist es, in einem Raum in dem die Luft still steht (das soll heißen, keine Heizung, kein Durchzug und das am besten einige Stunden lang vor dem Arbeiten) so eine Box aufzubauen, in der ebenfalls die Luft still ist. Also ich nehme da eine umgedrehte Plastikbox mit zwei Löchern für die Arme. 

Die Box wird reichlich mit Ethanol 70% ausgesprüht. 

So können Pilzsporen und andere Sachen sich absetzen und werden nicht mehr aufgewirbelt und das Ethanol desinfiziert dann zusätzlich.

 

Erstaunlicher Weise funktioniert das ganz gut, was ich anfänglich nicht erwartet habe.

 

Was aber Probleme bereitet ist das Einbringen von Explants. Ich habe jetzt etwas mit Rhododendren aus der Natur (also die, die bei uns im Garten eben stehen) herumexperimentiert und man muss dabei bedenken, dass draußen eben alles voller Sporen und Bakterien ist. Mit Samen habe ich noch nicht gearbeitet, aber wenn man fast reife bzw. reife, aber nicht geöffnete Früchte sammeln sollte, sollte das die ganze Sache erleichtern. Samen sind in einer Frucht ja immer steril.

Die Kunst hier besteht darin, das Explant-Material so gut zu sterilisieren, dass keinerlei Mikroorganismen überleben, aber die Pflanze schon. Mikroorganismen werden sich in jedem Fall schneller vermehren als die Pflanzen und die Kultur ist hinüber. Leider sind eigentlich alle Mittel, mit denen man Mikroorganismen hinreichend abtöten kann auch in einem gewissen Maße phytotoxisch.

 

Wenn man sich dazu Studien anguckt, wird man feststellen, dass auch etablierte InVitro Labore es nicht schaffen, Pflanzenmaterial von draußen mit einer 100% Quote zu desinfizieren. Dabei scheint 0.1%HgCl zwar immer noch ein guter Standard sein, aber für mich als Naturfreund wäre das mir nicht nur zu gefährlich, sondern ich verstehe nicht, warum man bei guten Alternativen, die nicht so umweltschädlich sind, zu Quecksilberverbindungen greifen muss. 

 

Ich arbeite, wie oben schon erwähnt, mit der ziemlich verbreiteten 10% Bleiche Lösung mit einem Detergens; in meinem Falle Tween20.

Ebenfalls habe ich einige Experimente mit NaDCC gemacht, aber das hat mich nicht allzu sehr überzeugt. Ich möchte noch einige andere Sachen ausprobieren und es gibt auch einige Paper darüber, wie geringe Mengen verschiedener Biozide den Medien beigemengt wurden, sodass sie die Quote von Kontaminationen sank, aber die Pflanzen keinen Schaden nahmen. Ziemlich interessant, in meinen Augen!

Antibiotika wären zumindest für Bakterien auch eine denkbare Lösung, jedoch finde ich den Gebrauch von Antibiotika hinsichtlich multiresistenter Keime bedenklich. Als Privatperson kommt man aber sowieso nur mit einer Infektion durch den Arzt an sowas.

 

Ich wollte euch hier also einen kleinen Abriss meiner Erfahrungen mitteilen. Den Rest dokumentiert Tobias ja auch sehr gut und ausführlich. Ich bin zwar überzeugt, dass man ohne LFH arbeiten kann, aber ich denke, dass eine LFH schon die beste Lösung ist. Man muss aber darauf achten, dass man wirklichen laminar flow hat. Einige Bauanleitungen aus dem Internet wollen die Konstruktion einer solchen laminar flow hood zeigen, jedoch sind das am Ende Gebläse hinter einem HEPA-Filter. Was bedeutet das?

Laminar flow ist eben "gerichteter Fluss". Es dürfen keine Verwirbelungen entstehen, sonst hält man irgendwelche Sporen oder andere Sachen in Verwirbelungen in seiner "turbulent" flow hood gefangen.

 

Tüftler kann ich die günstige Methode mit der Box weiterempfehlen, allen anderen aber eine LFH.

 

Viele Grüße

Oliver

[Oli C.]

Vielleicht noch einen kleinen Kommentar zum Lagern von Medien @partisanengärtner.

Die Dosen wie oben beschrieben hab ich testweise in den Kühlschrank gepackt, neben Champignons und anderem und die waren nach einer Woche okay und hatten auch später keine Kontaminationen. Wie lange die Phytohormone aber so halten, weiß ich nicht.

Bearbeitet 20. Juli 2023 von Oli C.

[Tobias Kulig]

Am 19.7.2023 um 13:30 schrieb Oli C.:

Einer Sache möchte ich Tobias vorab aber widersprechen: Es geht auch ohne Laminar Flow Hood!

Ich finde es klasse, wenn jemand andere Methoden probiert, Erfahrungen sammelt und auch positive Ergebnisse hat. Aber ich bin und bleibe ein Verfechter einer LFH!  Ich beharre nicht auf meiner Meinung, bloß weil ich so ein Ding hab. Wobei man sagen muß, daß es auch kein Profigerät ist, sondern eben selbst zusammengeschustert. Aber sie tut, was sie soll.

Jede Wette, Du schaust jeden Tag gezielt, ob Deine Kulturen noch sauber sind. Ich nicht! Ich schaue hin und wieder, ob neue Samen gekeimt sind. Wenn ich mal ne Kontamination habe, sehe ich die durch Zufall. Seit ich wieder angefangen habe, hatte ich gerade mal zwei. Aber hey, ist nur meine Meinung. Nicht falsch verstehen!

Am 19.7.2023 um 13:30 schrieb Oli C.:

Ich benutze selbst auch einen Schnellkochtopf als Autoklave und da Schnellkochtöpfe unter Druck auch auf 120°C kommen, sind es auch eigentlich normale Autoklaven. Für mich funktioniert das super.

Ja, ich kann mir gut vorstellen, daß das funktioniert. Ein Autoklav ist ja im Prinzip nix anderes. Ist halt bequemer. Ich drehe die Zeitschaltuhr auf meine Zeit und muß nur warten, bis sie abgelaufen ist.

 

Am 19.7.2023 um 13:30 schrieb Oli C.:

Ich benutze Gefäße vollkommen aus PP, die für Lebensmittel usw. gedacht sind. Sogenannte deli container oder ähnliches. Diese schließen sehr gut. Ich brenne in die Deckel immer zwei Löcher und verklebe eines mit 3 Lagen Micropore 3M Klebeband und auf das andere komm ein self healing plug. (Also ein selbstheilender Stopfen).

Wozu das ganze? Das Micropore ist verblüffender Weise ziemlich beständig und hält Verunreinigungen ab. Ich hab mehrere Versuche mit Medien gemacht, die für Bakterien ausgelegt sind, ohne sie zu inokulieren und die Medien blieben über Wochen mit dem zugeklebten Loch steril. Das tolle daran ist aber, dass jetzt ein Druckausgleich mögich ist und ich die Behälter geschlossen in den Schnellkochtopf stellen kann und beim herausnehmen nichts mehr verunreinigen kann, weil sie eben schon zu sind. 

Das halte ich für eine sehr gute Idee! Warum auch nicht? Für mich leider keine Option, da ich das nicht brauche! Aber ich halte diese Möglichkeit auf jedenfall für meine Spülgläser offen. Diese sind mit dem normalen Blechdeckel verschlossen, die ich in der LFH wegen des Unterdrucks kaum aufkriege! Vielen Dank für diesen Tipp!

Am 19.7.2023 um 13:30 schrieb Oli C.:

Und wie mache ich den Rest, wenn nicht in einer LFH? In einer SAB (still air box - "ruhige Luftbox").

 

Der Gedanke dahinter ist es, in einem Raum in dem die Luft still steht (das soll heißen, keine Heizung, kein Durchzug und das am besten einige Stunden lang vor dem Arbeiten) so eine Box aufzubauen, in der ebenfalls die Luft still ist. Also ich nehme da eine umgedrehte Plastikbox mit zwei Löchern für die Arme. 

Die Box wird reichlich mit Ethanol 70% ausgesprüht. 

So können Pilzsporen und andere Sachen sich absetzen und werden nicht mehr aufgewirbelt und das Ethanol desinfiziert dann zusätzlich.

Das, was Du beschreibst, ist eine Glovebox. Halte ich persönlich für Pfusch. Man mag durchaus diverse Erfolge haben, keine Frage. Aber für den regelmäßigen Betrieb viel zu umständlich und zeitraubend. Und an was liegts, wenn Du Kontaminationen hast? Wirst Du nie rausfinden können. Aber wenns bei Dir klappt, wieso nicht…

Am 19.7.2023 um 13:30 schrieb Oli C.:

Was aber Probleme bereitet ist das Einbringen von Explants. Ich habe jetzt etwas mit Rhododendren aus der Natur (also die, die bei uns im Garten eben stehen) herumexperimentiert und man muss dabei bedenken, dass draußen eben alles voller Sporen und Bakterien ist. Mit Samen habe ich noch nicht gearbeitet, aber wenn man fast reife bzw. reife, aber nicht geöffnete Früchte sammeln sollte, sollte das die ganze Sache erleichtern. Samen sind in einer Frucht ja immer steril.

Die Kunst hier besteht darin, das Explant-Material so gut zu sterilisieren, dass keinerlei Mikroorganismen überleben, aber die Pflanze schon. Mikroorganismen werden sich in jedem Fall schneller vermehren als die Pflanzen und die Kultur ist hinüber. Leider sind eigentlich alle Mittel, mit denen man Mikroorganismen hinreichend abtöten kann auch in einem gewissen Maße phytotoxisch.

Ja, Explantate sind ne ganz andere Hausnummer. Ich hab zwar früher schon ein paar probiert, aber alles gescheitert. Ich werde bald damit beginnen und viel testen. Da kann ich Dir den Tipp geben, es nur mit 20mm Tubes zu probieren. Da verbrätst Du nicht soviel Medium.

Am 19.7.2023 um 13:30 schrieb Oli C.:

Ich möchte noch einige andere Sachen ausprobieren und es gibt auch einige Paper darüber, wie geringe Mengen verschiedener Biozide den Medien beigemengt wurden, sodass sie die Quote von Kontaminationen sank, aber die Pflanzen keinen Schaden nahmen. Ziemlich interessant, in meinen Augen!

Antibiotika wären zumindest für Bakterien auch eine denkbare Lösung, jedoch finde ich den Gebrauch von Antibiotika hinsichtlich multiresistenter Keime bedenklich. Als Privatperson kommt man aber sowieso nur mit einer Infektion durch den Arzt an sowas.

Ich bin der Meinung, daß solche Dinge wie PPM, Antibiotika oder ähnliches nichts in einem Nährboden verloren haben. Wenn man sauber arbeitet, braucht man das nicht. Aber in Deinem Fall mit der Glovebox wird Dir wohl nix anderes übrig bleiben. 
Evtl. vorhandene Keime werden lediglich unterdrückt, aber nicht verhindert.

Am 19.7.2023 um 13:30 schrieb Oli C.:

Tüftler kann ich die günstige Methode mit der Box weiterempfehlen, allen anderen aber eine LFH.

Also ich weiß nicht! Wenn Leute zu einer Glovebox ermutigt werden, eine Menge Geld in die Hand zu nehmen, um nacher enttäuscht zu werden? Da leg ich doch lieber was drauf, und baue eine LFH.
 

Leute, ich möchte es nochmal betonen: Es geht hier nicht darum, auf Biegen und Brechen meine Methode an den Mann zu bringen und stur auf meiner Meinung zu beharren! Ich will einfach nur zu verstehen geben, daß man Invitro nicht mal kurz nebenbei probiert. Auch nicht mit einer Glovebox. Das funktioniert einfach nicht! 
Oli scheint ein bißchen Ahnung zu haben, das konnte ich rauslesen. Und ich denke, er weiß, was er tut. Wenn es bei ihm funktioniert, Glückwunsch! Aber generell zu behaupten, es geht auch ohne LFH, finde ich fast schon fahrlässig.

Naja, üblicher Spruch: Muß jeder selber wissen.
 

Grüße

Tobias

[Oli C.]

Hallo Tobias,

 

wie schon oben erwähnt, will ich dir die laminar flow hood nicht streitig machen, sondern empfehle diese. Es sei denn, man ist Tüftler und will eben etwas herumexperimentieren. 

 

Ich kann Dir aber versichern, dass ich nicht ständig auf die Kulturen gucke. Dafür muss man ja auch erstmal die Zeit finden.

 

Eine glove box habe ich keine! Ich habe wirklich eine SAB - also eine Box mit Löchern, aber ohne Handschuhe also gloves. Ich desinfiziere mir mit 70% Ethanol vor dem Arbeiten die Hände und Arme und fahre so ganz gut. 20 bis 30 Prozent meiner Kulturen sind kontaminiert. Das hört sich im Vergleich zu deinem Versuchen zwar viel an, aber man sollte bedenken, dass ich mit Explants Arbeite und die Protokolle und Studien, die ich bis jetzt gelesen habe, höchstens selbst nur eine Erfolgsrate von 80 bis 85% erzielen. Explants sind da eben schwieriger.

Allein in einer Studie, die Wasserstoffperoxid und eine Chlordioxidlösung kombiniert hat, habe ich Ergebnisse von über 90% mit 91% gesehen.

 

Ich habe vor zwei Wochen 18 Gefäße vorbereitet. In zwei Containern haben sich bis jetzt Kontaminationen an dem Pflanzengewebe gezeigt, das sich dann ausgebreitet hat und nur in einer einzigen Kultur hatte ich eine Kontamination, die nicht von dem Gewebe ausging. Man sieht ja ganz gut, von wo aus das kommt. Die Verunreinigungen bilden ja immer Kreise.

 

Ich habe einige Versuche mit Medien extra für Bakterien gemacht, um herauszufinden, wo ich Kontaminationen einbringen könnte. Jeden Schritt bin ich mit eigenen Medien abgegangen und hab dann ausgewertet und ggf. nachgebessert.

 

Ich will aber nochmal wiederholen, dass eine kontaminationsfreie Explantkultur nicht möglich ist. Nicht nur für uns Hobbyisten, sondern auch für professionelle Labore. Wie oben schon gesagt, erzielen diese in diversen Veröffentlichungen eine Erfolgsrate von 80 bis 85% (mit professionellen laminar flow hoods - wobei ich davon ausgehe, dass Tobias' flow hood nicht viel schlechter sein wird). Das hat mir ebenfalls ein Freund, der für eine Gärtnerei züchtet und im Studium und Beruf solche Dienste in anspruch genommen hat, berichtet. Genau deshalb gibt es groß angelegte Studien, die untersuchen, wie Zusätze von Bioziden im Medium hilfreich sein könnten. Wenn man Explantate in die Kultur bringt, sollte man immer kleine Stück einzeln in einzelne Container packen.

Die Empfehlung kleinerer Container ist gut und die sind schon länger angedacht.

 

Und wie gesagt: Zur einer SAB will ich gar nicht aufrufen und ich empfehle ja ausgerechnet eine LFH. Ich verstehe nur nicht, was Du mit den kosten meinst?

Eine große Plastikbox, einen gebrauchten Schnellkochtopf, Bleiche, Ethanol und anderes ist nicht gerade eine große Investition. Alleine die Medien und die Hormone sind nicht ganz günstig. Bzw teuer sind diese genau genommen nicht, nur werden diese nicht in kleinsten Mengen abgegeben.

 

Tobias, damit wir uns nicht falsch verstehen: Ich selbst empfehle eine LFH. Eine Glovebox oder SAB kann und wird sehr frustrierend sein. Wenn man damit Erfolg haben möchte, muss man da schon einiges an Zeit reinstecken. Mir persönlich bereitet sowas aber Freude und deshalb habe ich über Wochen herumprobiert und meine Protokolle sowie Abläufe angepasst.

Eine SAB funktioniert. Das ist meine Meinung und besonders in der hobbyistischen Mykologie (Speisepilze und speziellere Pilze...) werden SABs benutzt und Erfolge werden verzeichnet. Aber es ist eben nicht einfach mit einer SAB!

 

Grüße 

Oliver

 

PS: Für Explantate sollte man immer zwei verschiedene Mittel kombinieren. Ich fahre mit 70% Ethanol 1 Minute und 20% Bleiche für 30 Minuten ganz gut. Versuche mit einfachem Sterilisieren habe ich bis jetzt noch keine gemacht, aber da gibt es einige Studien zu, die einfache Sterilisation mit mehrfacher verglichen hat und bei der einfachen Erfolge von 40 bis 60% erfahren hat. 

Wer sich für diese ganzen Sachen interessiert, bekommt von mir gerne auch den Namen der Studien. Den müsste ich aber erst raussuchen und verzichte deshalb hier im Beitrag darauf, die alle namentlich zu erwähnen.

[Oli C.]

Als kleiner Anhang noch eine Kultur vom 19.06.2023 jetzt nach ziemlich genau 1. Monat. Ein Rhododendron sp. in der Multiplikation:

 

 

Und hier eine Kontamination, die vom Explantat ausging. Kann man hier wohl gut erkennen. 2B stammt aus meiner Versuchsreihe mit NaDCC. Hier habe ich 1500PPM NaDCC für 15Min zur Desinfektion benutzt und 50PPM im Medium gehabt. Das NaDCC schneidet schlechter als die Bleiche ab:

 

 

Wenn man Tobias' Bilder mit meinen vergleicht, wird schnell klar, dass Glas für eine fotografische Dokumentation des Ganzen um einiges geeigneter als PP ist.

Bearbeitet 20. Juli 2023 von Oli C.

[Ping Tina]

Hallo zusammen 

 

jetzt schreibe ich doch auch mal  normalerweise schau ich hier nur ab und an rein und bin interessierter, stiller Leser…

ich habe wohl schon zu viel in Labors und an Sterilbänken gearbeitet, dass ich Lust hätte, in meiner Freizeit mit meinem Hobby das Gleiche zu tun. Vor allem wenn man Experiment-Reihen hat, die es erfordern nachts den Wecker zu stellen, in die verlassene Uni zu fahren und an der Sterilbank zu sitzen, schwindet die Euphorie  

 

vor 41 Minuten schrieb Oli C.:

Wenn man Tobias' Bilder mit meinen vergleicht, wird schnell klar, dass Glas für eine fotografische Dokumentation des Ganzen um einiges geeigneter als PP ist.

Du kannst auch mit PP Boxen und Schalen gute Fotos machen. Die richtige Farbe des Hintergrunds, die Kamera/ das Objektiv und die Beleuchtung sind hier die maßgebenden Faktoren  das einzige Manko ist, wenn die Petrischalen innen beschlagen sind.

 

Liebe Grüße und allseits gutes Gelingen ohne Kontaminationen!

Tina 

[Tobias Kulig]

Am 20.7.2023 um 11:46 schrieb Oli C.:

wie schon oben erwähnt, will ich dir die laminar flow hood nicht streitig machen,

Hey Oli, alles gut! Wie ebenfalls erwähnt, gehts darum gar nicht. 
 

Am 20.7.2023 um 11:46 schrieb Oli C.:

Eine glove box habe ich keine! Ich habe wirklich eine SAB - also eine Box mit Löchern, aber ohne Handschuhe also gloves. 20 bis 30 Prozent meiner Kulturen sind kontaminiert.

Das ist im Prinzip fast das gleiche, mit oder ohne Handschuhe. Genau deshalb: 20-30% Kontaminationsrate! Ja, ich weiß, Explantate sind nicht einfach! Aber wenn ich eine so hohe Kontaminationsrate hätte, hätte ich schon lange aufgehört! Invitro mache ich nur mit entsprechenden, seltenen Arten (wo es sich eben lohnt) und wenn man vorher schon weiß, daß soviel draufgehen, ist das Wahnsinn!
Da wäre mir das Medium, die Zeit ect. viel zu schade. 
Das Problem ist, du weißt nicht wirklich, wo die Kontis herkommen und kannst deshalb auch nicht modifizieren. 

 

Am 20.7.2023 um 11:46 schrieb Oli C.:

Ich will aber nochmal wiederholen, dass eine kontaminationsfreie Explantkultur nicht möglich ist. Nicht nur für uns Hobbyisten, sondern auch für professionelle Labore.

Das kann ich mir nicht vorstellen! 
 

Am 20.7.2023 um 11:46 schrieb Oli C.:

man Explantate in die Kultur bringt, sollte man immer kleine Stück einzeln in einzelne Container packen.

Die Empfehlung kleinerer Container ist gut und die sind schon länger angedacht.

Yep. Ich mach sowas mit 20mm Tubes. Die mit dem blauen Schraubdeckel.

 

Am 20.7.2023 um 11:46 schrieb Oli C.:

Eine Glovebox oder SAB kann und wird sehr frustrierend sein.

Ganz genau. Nichts anderes versuche ich die ganze Zeit zu erklären.

 

Am 20.7.2023 um 11:46 schrieb Oli C.:

Ich fahre mit 70% Ethanol 1 Minute und 20% Bleiche für 30 Minuten ganz gut.

Das ist leider der falsche Ansatz! Bei Explantaten fängt man mit der niedrigsten Dosis an. 20% Bleiche ist viel zu stark!  Obwohl, kommt drauf an, was man vor sich hat. Für Explantate fängt man generell mit einer niedrigen Dosis an, dafür aber länger. Und arbeitet sich Schritt für Schritt nach oben. Abhängig von den kommenden Kontaminationen. Aber es kommt, wie erwähnt, auf die jeweilige Art an. Dicke, fette Explantate vertragen natürlich ne stärkere Konzentration an Bleiche!

Mein Schwerpunkt Drosera hat z.B. verhältnismäßig dünne Blätter. Ich muß da mal meine früheren Protokolle durchforsten…Aber ich denke, Du verstehst, was ich meine? Man beginnt deshalb mit einer niedrigen Dosis, weil man ja so wenig Gewebe wie möglich zerstören will. Nimmt man z.B. eine zu hohe Konzentration, hat man zwar keine Kontaminationen mehr, aber dafür ist das Explantat am Arsch. Wollen wir ja nicht….

 

Gruß

Tobias

[Oli C.]

Hallo Tobias,

 

da ich hier neu im Forum bin, will ich mit keinem irgendwie streitig werden. Ich will hier im Forum meine Erfahrungen weiter geben und selbst von den Erfahrungen anderer profitieren. Jedoch verwirren mich deine Aussagen langsam.

 

Meintest Du nicht weiter oben, dass Du noch nicht mit Explantaten gearbeitet hast? Auf welcher Basis schätzt Du denn ein, dass meine Kontaminationen so schlecht sind?

Ich habe letztens 17 Gefäße angesetz, von denen 3 Kontaminationen zeigten. 2 von den dreien zeigte  Kontaminationen direkt am Explantat wie oben zu sehen. 14 geglückte Kulturen von 17 sind eine Erfolgsrate von gerundet 82%. Kein Explantat ist abgestorben.

Anscheinend sind meine Erfolge nachdeinem Maßstäben nicht ausreichend. Das ist soweit in Ordnung!

 

vor einer Stunde schrieb Tobias Kulig:

Aber wenn ich eine so hohe Kontaminationsrate hätte, hätte ich schon lange aufgehört!

 

Jetzt ist es aber so, dass man ohne Quecksilberchlorid keine signifikant besseren Ergebnisse erziehlen kann. Hier stelle ich mal Ergebnisse zweier Studien vor:

 

Hier hat man versucht, das sterilisieren von Explantaten von Pfirsichbäumen aus dem Feld zu optimieren. Die beste Überlebensrate lag hier bei 85%:

"The least culture contamination and

minimum tissue death of 9.51% and 4.75%, respectively,

and the highest culture survival (85.71%) were recorded

when explants were disinfected with 0.25% active

chlorinated local bleach for 15 min. These findings agree

with the result of Ahmad et al. (2003): the application of

NaOCl at 0.25% (w/v) for 10 min gave minimum death

(5%) and maximum survival (55%)."

 

 

 

Hier (Achtung, Download startet direkt!) hat man sich das für Phanera sirindhorniae angeguckt. Hier heißt es:

 

"After sterilization and cultivation for 14 days, the
highest mean percentage of shoot tips disinfection and
survival (88.89%, 55.56%) were obtained when using the
10% NaOCl for 10 min and followed by 10% NaOCl for
15 min. The nodal explants were successfully surface
sterilization (77.78%) with the 10% NaOCl for 10 min
and followed by 15% NaOCl for 15 min. However, an
optimum value of nodal survival (51.85%) could be
obtained with 10% NaOCl for 10 min and followed with
5% NaOCl for 5 min whereas the lowest disinfection
percentage (33.33%) was observed for only soaked one
step in NaOCl 10% in both explants (Fig. 2)."

 

Also eine Überlebensrate von gerundeten 56% Prozent!

 

Jetzt frage ich mich natürlich, mit welcher Messlatte Du meine Ergebnisse vergleichst und somit implizit weiterhin sagen willst, dass eine SAB nicht zum Ziel führe. Solltest Du Protokolle haben, die ohne Antibiotika, Quecksilber und anderen Schwermetallen bessere Erfolgsraten als die meine, aber auch als die diverser Studien haben, dann teile sie doch bitte mit uns. Sollte es möglich sein, signifikant besser Ergebnisse zu erziehlen, würde ich gerne wissen wollen, wie das gehen soll.

 

Jeder, der hier mitliest un des Englischen mächtig ist, kann doch bitte mal nach "still air box" suchen und kann sich andere Erfahrungen als die meine angucken und realisieren, dass es definitiv möglich ist mit einer SAB Erfolge zu erziehlen und eine SAB mit Nichten Pfusch darstellt. Mir tut es Leid, dass ich Dir hier so widersprechen muss, Tobias, aber die Daten sprechen für etwas anderes. Zwar empfehle ich immer noch eine LFH, aber eine SAB oder gar glovebox funktioniert auch!

 

Ich finde es schade, dass ich direkt hier so auf einen Widerspruch stoße. Ich werde mich zum Thema TC dann wohl erstmal nicht mehr melden, es sei denn, eine gewisse Sachlichkeit kann vorausgesetzt werden. Ich will doch keinem etwas Böses. Du musst mir und meinen Ergebnissen nicht glauben und kannst sie zurecht skeptisch hinterfragen, aber ich finde es nicht gerade die feine Art, meine Ergebniss und Erfahrungen so zu untergraben.

 

Viele Grüße

Oliver

[Ping Tina]

Hi Oli

 

wenn du länger hier im Forum liest, wirst du merken, dass der „streitige Tonfall“ einfach Tobias Kuligs Stil ist. Das hat nichts mit dir persönlich zu tun. Auch nicht mit deiner Herangehensweise oder deiner TC Arbeit - die ich übrigens als ziemlich professionell empfinde. 
Was ich damit sagen möchte; ich hoffe du lässt dir davon nicht die Lust am Forum im Keim ersticken  denn das ist nicht nötig.

 

Schöne Grüße 

Tina 

[Tobias Kulig]

vor 19 Stunden schrieb Oli C.:

Meintest Du nicht weiter oben, dass Du noch nicht mit Explantaten gearbeitet hast?

Natürlich hab ich auch schon mit Explantaten gearbeitet. Nur eben nicht erfolgreich (war aber zu meinen Anfängen vor vielen Jahren). Das lief bei meinen invitro Anfängen so nebenher, da ich das meiste mit Samen gemacht habe. Das ging dann auch unter. Ich bekam z.B. auch Cephalotus Blätter sauber, die dann zwar keine Kontaminationen mehr aufwiesen, aber dann durch die phenolen Blutungen draufgingen. Letztendlich lag mein Fokus eigentlich immer nur auf Samen, so das ich die Arbeit mit Explantaten vorerst (bis heute) vernachlässigte. Das wird sich aber ändern.

 

vor 19 Stunden schrieb Oli C.:

Auf welcher Basis schätzt Du denn ein, dass meine Kontaminationen so schlecht sind?

Ich ging davon aus (kam für mich jedenfalls so rüber), daß die 20-30% Kontaminationen Dein allgemeiner Durchschnitt ist. Und das wäre mir persönlich zuviel. 

 

vor 19 Stunden schrieb Oli C.:

Jetzt frage ich mich natürlich, mit welcher Messlatte Du meine Ergebnisse vergleichst und somit implizit weiterhin sagen willst, dass eine SAB nicht zum Ziel führe. Solltest Du Protokolle haben, die ohne Antibiotika, Quecksilber und anderen Schwermetallen bessere Erfolgsraten als die meine, aber auch als die diverser Studien haben, dann teile sie doch bitte mit uns. Sollte es möglich sein, signifikant besser Ergebnisse zu erziehlen, würde ich gerne wissen wollen, wie das gehen soll.

Wie erwähnt, wegen der hohen Kontaminationsgefahr. Ich hab kein einziges Protokoll, wo diverse Antibiotika ect. drin sind. Wirds auch nie geben. 
Wenn ich demnächst mit Explantaten weitermache (natürlich erstmal Drosera), werde ich hier auch darüber berichten. 
 

vor 19 Stunden schrieb Oli C.:

Ich finde es schade, dass ich direkt hier so auf einen Widerspruch stoße.

Ich vertrete hier nur meine Meinung und bei der bleibe ich auch. Wie Ping Tina unten schon erwähnt hat, hat das nichts im geringsten mit Dir zu tun!

 

vor 19 Stunden schrieb Oli C.:

Ich werde mich zum Thema TC dann wohl erstmal nicht mehr melden, es sei denn, eine gewisse Sachlichkeit kann vorausgesetzt werden.

Weißt Du, was ich schade finde? Ich habe hier einen Thread eröffnet, in dem ich meine Methoden vorstelle und auch detailliert beschreibe. Ich glaube nicht, daß das ein anderer getan hätte! Und es endet in so einer Diskussion….Aber hey, ich bin trotzdem nicht gleich eingeschnappt. Alles gut! Ich bin durchaus kritikfähig.

 

vor 19 Stunden schrieb Oli C.:

Ich will doch keinem etwas Böses.

Ich auch nicht.

 

vor 19 Stunden schrieb Oli C.:

aber ich finde es nicht gerade die feine Art, meine Ergebniss und Erfahrungen so zu untergraben.

Wer untergräbt hier was? Nochmal: Ich vertrete hier nur meine Meinung und das in meinem eigenen Thread….

 

Gruß

Tobias

Bearbeitet 22. Juli 2023 von Tobias Kulig

[Tobias Kulig]

vor 19 Stunden schrieb Ping Tina:

wenn du länger hier im Forum liest, wirst du merken, dass der „streitige Tonfall“ einfach Tobias Kuligs Stil ist.

Tina, das ist so eine Sache. Wenn man in einer Diskussion (oder was auch immer) etwas schreibt, dann kommt das IMMER anders rüber. Da helfen auch keine Smileys. Wenn mein „streitiger Tonfall“ so rüberkommt (ich sehe es tatsächlich manchmal selber, wenn ich meine eigenen Texte lese), liegt das nur an meiner Schreibweise und nicht an meiner Persönlichkeit. Ich bin grundsätzlich nicht auf Krawall aus. Nur vertrete ich eben auch Standpunkte, die ich auch verteidige. In der aktuellen Diskussion gibts bestimmt einige, die derselben Meinung sind (Man muß allerdings auch die Eier dazu haben, sich zu äußern).

 

vor 19 Stunden schrieb Ping Tina:

Das hat nichts mit dir persönlich zu tun. 

Absolut nicht!

 

vor 19 Stunden schrieb Ping Tina:

Auch nicht mit deiner Herangehensweise oder deiner TC Arbeit 

Hää?

 

vor 19 Stunden schrieb Ping Tina:

Was ich damit sagen möchte; ich hoffe du lässt dir davon nicht die Lust am Forum im Keim ersticken  denn das ist nicht nötig.

Ich glaube nicht, daß Oli sich dadurch die Lust am Forum nehmen läßt. So schätze ich ihn absolut nicht ein. Stimmts, Oli? 
 

Gruß

Tobias

[Christian357]

Es ist doch gut, wenn auch unterschiedliche Meinungen zusammenkommen.

Jeder hat so die Möglichkeit, seine Entscheidungen abzuwägen.

Ab einem gewissen Punkt hat man dann halt alles auf den Tisch gelegt und dem Leser zu überlassen.

 

Tobias entschlossenen und aufgeweckten Stil finde ich immer sehr spannend und Olli hat sehr gut seinen Standpunkt belegen können. Beide haben wertvolle Erfahrungen und eine Diskussion um persönliche Angriffe, die sicher nicht gedacht sind, verwässert den Thread nur.

 

Darum weiter Wissen und Leidenschaft teilen und gut ist.

[Oli C.]

Hallo zusammen,

 

nein, ich werde mir die Freude am Forum nicht so schnell nehmen lassen und ggf. an anderer Stelle genauer auf meine Erfahrungen eingehen. Mich störte eben nur, dass eine bestimmte Erfolgsquote als möglicherweise nicht befriedigend genug hingestellt wurde, obwohl es ziemlich klar ist, dass eine sognifikant bessere Erfolgsquote nicht möglich scheint. Deshalb oben die zitierten Quellen. Ich persönlich möchte ungerne eine 90%+ Erfoglsquote anstreben, wenn es ziemlich ersichtlich ist, dasd diese bei Explantaten einfach nicht zu erzielen ist - egal ob Zuhause, im Labor oder in Studien.

 

Aber ich lasse das jetzt erstmal in Frieden und erstelle möglicherweise dann selbst einen Beitrag, wo ich genauer auf meine Erfahrungen eingehe und dort könnte man diese dann nochmal diskutieren.

 

Frohes Gelingen und schöne Grüße

Oliver

[Tobias Kulig]

vor 9 Stunden schrieb Oli C.:

nein, ich werde mir die Freude am Forum nicht so schnell nehmen lassen

Und das ist auch gut so! Unser Hobby ist viel zu schön und interessant, um sich wegen ein paar Meinungsverschiedenheiten die Freude am Forum nehmen zu lassen.

 

vor 9 Stunden schrieb Oli C.:

Aber ich lasse das jetzt erstmal in Frieden und erstelle möglicherweise dann selbst einen Beitrag, wo ich genauer auf meine Erfahrungen eingehe und dort könnte man diese dann nochmal diskutieren.

Sehe ich genauso . Und ich werde hier wieder normal weiterposten, wenn es was Neues gibt.

 

Und das gibt es auch schon: Mein Autoklav ist leider hinüber (von einem Oldtimer mit Bj. 1986 kann man nicht mehr viel erwarten). Er hat aber bis zum Schluß zuverlässig gearbeitet! Ich hab jetzt nen aktuelleren geschossen (aber auch gebraucht), der kommt allerdings erst nächsten Freitag und ich hab nur noch 3 Gläser (mit Medium) übrig. 

Gruß

Tobias

[Andreas Wistuba]

vor 13 Stunden schrieb Tobias Kulig:

Wie erwähnt, wegen der hohen Kontaminationsgefahr. Ich hab kein einziges Protokoll, wo diverse Antibiotika ect. drin sind. Wirds auch nie geben. 
Wenn ich demnächst mit Explantaten weitermache (natürlich erstmal Drosera), werde ich hier auch darüber berichten. 

Ohne Antibiotika und z.T. auch Fungizide kommst Du bei problematischen Explantaten aber oft nicht weiter. Bei Kontaminationen im Gewebe oder in tieferen Oberflächen-Furchen kommt man mit der Bleiche einfach nicht hin.
Aber klar, normalerweise wird das nur gemacht, um ein Explantat "sauber" zu kriegen. 

Viele Grüße
Andreas

[Tobias Kulig]

Grüß Dich Andreas,

wenn einer Bescheid weiß, dann Du! Ich hab früher mal tatsächlich Cephalotus Blätter sauber bekommen. Und bei denen sind gewisse Keime auch endogen bzw. tief im Gewebe. Und ich hab sie nach vielen Versuchen auch sauber bekommen. Ich weiß jetzt aber echt nicht mehr, mit was. Bleiche? NaDCC? Ich muß Da echt mal in meinen Protokollen rumkramen. Ich weiß aber noch, daß sie sehr lange im Sterilisationsbad lagen. Logischerweise dann mit einer sehr geringen Dosis.
Das war ziemlich am Anfang, als ich mit Invitro begann. Da wollte ich unbedingt Cephalotus im Glas haben. Letztendlich sind sie durch Phenolics draufgegangen, weil ich noch nicht gewußt habe, wie sie dann zu behandeln sind. Ich hätte sie nur 2-3x umlegen müssen. Wußte ich aber damals noch nicht.

Mit meiner Gattung Drosera habe ich eigentlich keine Bedenken, sie mit Bleiche sauber zu gekommen. Da sie kein tiefes Gewebe besitzen. Mit einer sehr niedrigen Dosis für eine gewisse Zeit X. Aber wir werden sehen, da ich es gründlich austesten werde.
Ich hätte sogar noch das PPM da, das manche ins Medium mixen, um Keime zu unterdrücken. Habs aber nie eingesetzt. 
 

Oh, mir ist grad was evtl. Wichtiges eingefallen (nach so vielen Jahren): Früher nahm man auch flüssiges MS Medium zum sterilisieren (vielleicht heute auch noch). Wenn ich es noch richtig im Kopf habe, um die letzten vorhandenen Keime rauszulocken oder irgendwie sowas. Aber genau weiß ich es auch nicht mehr, ist zu lange her. Da kannst Du bestimmt was dazu sagen, Andreas…..
 

Grüße

Tobias

[Andreas Wistuba]

vor 12 Minuten schrieb Tobias Kulig:

 

Oh, mir ist grad was evtl. Wichtiges eingefallen (nach so vielen Jahren): Früher nahm man auch flüssiges MS Medium zum sterilisieren (vielleicht heute auch noch). Wenn ich es noch richtig im Kopf habe, um die letzten vorhandenen Keime rauszulocken oder irgendwie sowas. Aber genau weiß ich es auch nicht mehr, ist zu lange her. Da kannst Du bestimmt was dazu sagen, Andreas…..

Hallo Tobias,
Flüssigmedien machen gerade dann Sinn, wenn Di 2-3 Passagen mit Antibiotika machst, damit das Explantat regelrecht imprägniert wird.
Ich habe Antibiotika hauptsächlich in meiner Amorphophallus-Phase genommen. 
Wenn Dir eine Knolle abgammelt, Du die aber noch IV bekommen möchtest, hast Du es halt mit einem unterirdischen kranken Organ zu tun.
Da hilft nur noch die Atombombe

Grüße
Andreas

[Tobias Kulig]

vor 9 Stunden schrieb Andreas Wistuba:

Flüssigmedien machen gerade dann Sinn, wenn Di 2-3 Passagen mit Antibiotika machst, damit das Explantat regelrecht imprägniert wird.

Klingt plausibel, vielen Dank für die Info.

 

vor 9 Stunden schrieb Andreas Wistuba:

Da hilft nur noch die Atombombe

Nur eine?

[jp95]

Hallo Tobias, ich möchte mich für all diese Informationen bedanken, es ist wirklich sehr interessant, deine Ergebnisse zu verfolgen. Ich praktiziere seit einiger Zeit auch In-vitro-Kulturen. über Fleischfresser und es ist immer von Vorteil, so viele Meinungen und Methoden wie möglich zu haben, denn jeder hat kleine Tipps (oder tolle Tipps), die das können wirklich einen Unterschied machen und die Ergebnisse verbessern. Ich habe ein paar Fragen zum Medium, das für die Pinguiculas planifolia verwendet wird. Wie hoch ist die Konzentration des MS-Mediums und haben Sie zusätzliche Produkte wie Hormone hinzugefügt? Mir selbst ist es einige Male mit gemäßigten und mexikanischen Pinguicula gelungen aus Samen, aber nie mit so spektakulärem Wachstum. Achten Sie darauf, diesen Beitrag auf Deutsch zu schreiben. Ich verwende Google Trad, da ich kein Deutsch spreche und daher nicht die geringste Ahnung von der Qualität der Übersetzung habe. Nochmals vielen Dank für all diese Informationen. jp