Allgemeine Fragen Tissue Culture / In-vitro

[Tobias Kulig]

vor 11 Stunden schrieb crash:

Reicht ein H13 Filter oder muss es ein H14 sein? Finde da viele Meinungen darüber. 

 

Auf die anderen Sachen mit dem Chinosol antworte ich später noch nachträglich bzw mache einen Nachtrag

H14! Wenn Du einen H13 nimmst, mußt Du Dich wieder fragen, ob die Kontaminationen wegen dem Filter kommen oder durch unsauberes arbeiten. Kauf Dir einmal einen H14, dann hast Du sehr lange Zeit Ruhe. Ich hab immer noch den ersten drin! Ich hab zwar einen nagelneuen Filter vorrätig, aber da warte ich noch mit dem Wechsel.

Mit dem Chinosol kannst Du allenfalls die Symptome behandeln, aber nie die Ursache. 

Bearbeitet 16. Mai 2023 von Tobias Kulig

[crash]

Hier mal ein kleiner Test  ob das installierte uvc Licht in der Box überhaupt etwas bringt.

Beide Petrischalen standen undessinfiziert geöffnet in meiner Küche. Die linke Petrischale kam anschließend noch für 20min unter die Uvc Lampe, während die rechte Petrischale unbehandelt blieb.

Bei der rechten Petrischale hat sich bereits am 15.05 eine Konti gebildet (vermutlich Schimmel) während die linke bisher noch sauber ist

[Oli C.]

Hallo zusammen,

 

möglicherweise interessiert ihr euch auch hier für meinen Senf. Wenn nicht, ist das auch okay. Tobias hat aber eigentlich alles gesagt.

 

Pflanzen haben diverse phenolische Substanzen, die verschiedene Funktionen übernehmen. Bei einer Verletzung werden Oxidantien freigelassen, die diese phenolischen Substanzen oxidieren. Diese Oxidatien sind aber wichtig! So desinfizieren Pflanzen in freier Wildbahn ihre Wunden. In der TC benutzen wir ja auch oft oxidierende Mittel zur Sterilisation.

Schlussendlich entsteht im Medium dann Melanin, welches braun ist. Starkes Bräunen macht Dir die Kultur kaputt.

 

Wie Tobias schon sagte, bleibt einem da entweder die Möglichkeit, so lange umzusetzen, bis sich das im Rahmen hält oder man benutzt Aktivkohle im Medium. 

Antioxidantien wie z.B. Zitronensäure sollen da auch helfen können, jedoch habe ich dazu keinerlei Erfahrungen. Möglicherweise würde beim Spülen mit sterilem Wasser nach dem Desinfizieren ein Spülen in einer sterilen wässrigen Zitronensäurelösung helfen. Das müsste man ausprobieren.

 

Ich finde es interessant, dass Du UVC benutzt! Daran habe ich auch gedacht, aber mich dagegen entschieden, weil es doch stark Gewebe angreift: pflanzliches als auch menschliches!

Es gibt einige Studien dazu, die untersuchen, welche UV Strahlung das Braunwerden unterdrückt bzw. fördert. Ich kann Dir aber gerade nicht aus dem Kopf sagen, wie da der Status Quo ist.

 

Aber, was ich empfehlen kann, sodass man nicht immer umsetzen muss:

Mach Dir doch mehrere Gefäße mit Medium fertig: 3 oder gar 5 Stück.

Mach Dir entsprechend so viel Material fertig, sodass Du pro Container nur ein Gewebestück hast und dann schau mal, wie sich das verhält. Meistens hat man da Glück und es bleiben genügend am Leben, weil sie sich mit der phenolischen Bräunung nicht umgebracht haben. So handhabe ich das zumindest.

Ein ständiges Umsetzen kann sehr lästig werden. Besonders, wenn man mehrere verschiedene Proben InVitro hat. Dazu kommt auch noch, das jedes Umsetzen potentiell eine Kontamination bedeuten könnte.

 

 

Und generell zu den Kontaminationen: Ich würde raten, Dir mal ein Rezept für Bakterien- bzw. Pilzkulturen rauszusuchen. Das geht mit Ei z.B. ganz gut. Du kannst dann mal jeden Schritt durchgehen und schauen, was bei Dir anfällig für Kontis sein könnte. Erst dann würde es Sinn machen, zu überlegen, wie man sowas löst.

Ich persönlich bin so vorgegangen, dass ich 3 Gefäße mit so einem Medium vorbereitet habe, die im Schnellkochtopf autoklaviert habe und dann für einige Wochen auf die Fensterbank gestellt habe. Es gab keine Kontis, also wusste ich, dass mein Autoklavierungsprozess funktionert.

Danach habe ich das gleiche Medium wieder angemischt und sie in meiner SAB kurz geöffnet und wieder geschlossen. Danach wieder beobachtet. So kann man systematisch herausfinden, wo denn Kontis bei einem zu befürchten sind.

 

 

Aber, wie ich das schon im anderen Post angemerkt habe, mach Dir eine LFH. Würde ich nochmal anfangen und hätte ich nicht so viel schon ausprobiert, würde ich auch zur einer LFH greifen. Am Ende frustriert Dich das herumrüfteln mit einer SAB bzw. Glovebox so sehr, dass Du keine Lust mehr auf TC hast. Das will ja keiner!

 

Grüße und fröhliches Vermehren

Oliver

[crash]

Hat es einen bestimmten Grund warum sie in manchen Behälter so klein bleiben? Eigentlich ist nur das Glas rechts schön gewachsen. (Sind alle vom 09.05) und der Winzige Capensis auf dem anderen Bild ist auch sehr winzig geblieben. Ist zwar schnell gemeint, und einer davon ist auch noch grün, aber ist nie gewachsen. 

Nährmedium war/ist das was du (Tobias)  für deine Drosera in dem Erklärungs Thread verwendent hast

[Tobias Kulig]

vor 18 Stunden schrieb crash:

Hat es einen bestimmten Grund warum sie in manchen Behälter so klein bleiben? 

Wie genau autoklavierst Du? Kannst Du die Zeiten nennen und den Druck?

[crash]

Das war mit dem schnellkochtopf, zwischen 20-25 Minuten unter dem Druck

Und bis der Druck aufgebaut ist dauer 4-5 Minuten auf der Induktionsplatt

[Tobias Kulig]

vor 10 Stunden schrieb crash:

Das war mit dem schnellkochtopf, zwischen 20-25 Minuten unter dem Druck

Und bis der Druck aufgebaut ist dauer 4-5 Minuten auf der Induktionsplatt

Mmh, sollte eigentlich passen. Das heißt, 4-5 Minuten + 20-25 Minuten, also 30 Minuten. Wie lange dauert die Abkühlzeit bzw. wann machst Du den Schnellkochtopf auf?

Ich will darauf hinaus, daß man das Medium auch totkochen kann, was sich dann auf das Pflanzenwachstum auswirken kann. Aber das scheint bei Dir soweit ok zu sein.

Ich habe seit 2 Wochen einen neuen „gebrauchten“ Autoklaven (erst kürzlich generalüberholt), der weitaus besser ist als der alte. Ich stelle die Zeitschaltuhr auf die von mir angebrachte Markierung (siehe Bild, habe ich austimen müssen). Das ist der einzige Nachteil, die Zeitschaltuhr ist nicht in 5min Strichen skaliert. Nur 25min und 45min.

Er heizt relativ langsam hoch und er hat die 121 Grad und 1 bar Druck erreicht, wenn eine Restlaufzeit von etwa 20 Minuten erreicht ist. Diese wird dann die Restlaufzeit exakt gehalten. Er läßt dann relativ schnell den Druck ab und ich mache sofort auf, daß die Hitze raus kann. 

[Tobias Kulig]

In meiner Beschreibung habe ich zwei Standardmedien beschrieben:

1/2 MS (auf 50% runter verdünnen)

1/3 MS (auf ca. 30% runter verdünnen)

Dann kommts noch auf den Zuckergehalt an!

 

Bestimmte Arten müssen in eine bestimmte Mediumstärke, um gut zu wachsen.
 

Um welche Arten gehts eigentlich in den Gläsern?

[crash]

Das in den Gläsern sind alles Dionaeas ausser das eine Glas das war Capensis mit diesen winzigen Keimlingen.

Bisher hab ich immer dieses 1/3 Medium gemacht, in 2 Gläsern wachsen die Dionaeas auch ganz okay.

 

Jetzt hab ich ein ganz anderes Problem, mein Medium wird nichtmehr fest, 3 Versuche alle 3 machen kein anstand fest zu werden, das einzigste was anders ist ist das Aktivkohle mit dabei ist, aber das Medium zuvor mit Aktivkohle wurde auch ganz normal fest, ist auch nur 0,1g auf 250ml, wollte diesmal extra ein Paar mehr Behälter vorbereiten um die Cephalotus regelmäsig umsetzen zu können wegen dem Phiolen Bluten. PH Wert 5,65, 7,5g Zucker, 0,365MS, 0,9g Agar.

Beim ersten mal hab ich vor dem agar die aktivkohle hinzugegeben jetzt beim letzten mal nach der dem Agar.

Ich werd nicht schlau warum es nicht fest wird

[Tobias Kulig]

Am 11.8.2023 um 09:21 schrieb crash:

zwischen 20-25 Minuten unter dem Druck

1 bar?

 

vor 9 Stunden schrieb crash:

Bisher hab ich immer dieses 1/3 Medium gemacht, in 2 Gläsern wachsen die Dionaeas auch ganz okay.

Dann haben wir schon den ersten Fehler: Das Grundrezept ist in den meisten Fällen 1/2 MS, also 50%.

 

vor 9 Stunden schrieb crash:

Jetzt hab ich ein ganz anderes Problem, mein Medium wird nichtmehr fest, 3 Versuche alle 3 machen kein anstand fest zu werden, 

Wie stellst Du Dein Medium her? Rührst Du Deine Sachen alle in kaltes Wasser und stellst es dann in den Schnellkochtopf?

 

vor 9 Stunden schrieb crash:

PH Wert 5,65, 7,5g Zucker, 0,365MS, 0,9g Agar.

Auf welcher Menge Medium basieren Deine Mengenangaben? 1/2 Liter oder 1 Liter?

[crash]

Die Mengen beruhen auf 250ml,

Ja ich dachte wenn es in 2 Gläser gut wächst dürfte das Medium bzw die Zusammensetzung ja nicht so verkehrt sein, sonst wäre es in diesen 2 Gläsern auch so mickrig.

 

Habe den Fehler fürs aushärten gefunden, rühre es auf dem magnetrüher mit Wärmeplatte.

Vorher immer auf 95°C, hatte aber gelesen das das Agar sich bei 80-85grad schon gut mischen lässt, wusste nicht das die Hitze dann auch eine Rolle für das gelieren spielt, bei 95Grad funktioniert das gelieren.

 

Ob der Topf 1Bar erreicht weiss ich leider nicht, weiss nur das es danach Steril ist.

Ich lass die Gläser erst gelieren bevor sie steril gemacht werden, weil sie davor nochmal extra verpackt werden, was im flüssigen Zustand manchmal nicht so gut funktioniert.

Habe dir mal eine PN geschickt bzw mache ich gleich 

[Tobias Kulig]

vor 16 Stunden schrieb crash:

Ja ich dachte wenn es in 2 Gläser gut wächst dürfte das Medium bzw die Zusammensetzung ja nicht so verkehrt sein, 

Das zeigt mir, daß Du Dir keinerlei Mühe gibst, selbst im Internet zu recherchieren. Du probierst nur und hoffst, daß andere Deine Probleme lösen!

Das Internet ist voll mit Protokollen für einfache Arten wie Dionaea, D. capensis ect.: 1/2 MS, 30g Zucker, pH 5.65

Damit funktioniert z.B. ein Großteil der Drosera.

 

vor 16 Stunden schrieb crash:

Die Mengen beruhen auf 250ml,

Ja ich dachte wenn es in 2 Gläser gut wächst dürfte das Medium bzw die Zusammensetzung ja nicht so verkehrt sein, sonst wäre es in diesen 2 Gläsern auch so mickrig.

 

Habe den Fehler fürs aushärten gefunden, rühre es auf dem magnetrüher mit Wärmeplatte.

Das ist aber nicht der Fehler, sondern richtig.

 

vor 16 Stunden schrieb crash:

Ich lass die Gläser erst gelieren bevor sie steril gemacht werden, 

Dann wunderts mich nicht, das ist der völlig falsche Ansatz! Nochmal wie ichs mache, nämlich mit ner simplen Kaffeekanne aus Glas (da sieht mans besser):

 

1. halber Liter Wasser einfüllen, dabei Rührwerk einschalten (Heizung noch auslassen)

2. Zucker rein und auflösen lassen

3. abgewogenes Medium rein, gut mischen lassen

4. pH Meter rein (vorher kalibrieren) und pH auf 5.65 hochfahren

5. Heizung an

6. erwärmen, bis sich das Glas der Kaffeekanne beschlägt (nicht zu stark erhitzen, macht später der Autoklav)

7. abgewogenes Agar rein und sehr gut untermischen lassen, Heizplatte kann schon abgeschaltet werden

8. Sofort in die Gläser abfüllen

9. Deckel drauflegen, nicht zuschrauben (Überdruck!)

10. Alufolie drauflegen und mit den Händen umformen

11. In den Autoklav (Schnellkochtopf) und anmachen

12. Zeit abwarten, Gläser rausholen und 10min abkühlen lassen

13. Jetzt die Deckel fest zuschrauben (mit Handschuhen, ist sehr heiß)

14. Erst jetzt gelieren lassen (ich mach das über Nacht)

15. Fertig. Du kannst loslegen

 

 

 

 

[crash]

vor 2 Stunden schrieb Tobias Kulig:

zeigt mir, daß Du Dir keinerlei Mühe gibst, selbst im Internet zu recherchieren. Du probierst nur und hoffst, daß andere Deine Probleme lösen!

Das Internet ist voll mit Protokollen für einfache Arten wie Dionaea, D. capensis ect.: 1/2 MS, 30g Zucker, pH 5.65

Damit funktioniert z.B. ein Großteil der Drosera.

 

Naja das würde ich jetzt so nicht unterschreiben, für mich sind das alles lediglich Versuche und von den anderen erfolgeb wurde hier ja garnicht gesprochen. Und dionaea Samen sind auch nicht mein Ziel, 50ml Medium zu kochen gestaltet sich nur etwas schwieriger deswegen die 250ml und sind eben für meine cephi Versuche, da ich jedesmal noch Medium übrig habe nutze ich es für das was grade da ist. Mir geht's auch nicht darum das es Monate später ein erfolgreiches Glas wird, mir gehts darum das die Keimung funktioniert und alles noch steril ist. Es war lediglich auffällig das 2 Gläser schön wachsen während die anderen nicht, deswegen dachte ich es muss ein anderer grund als das Medium haben, denn wenn es am Medium läge wäre aus meiner Sicht die 2 anderen Gläser auch nicht ansehnlich gewachsen. Diese Gläser waren mir jetzt auch nicht wichtig aber grund genug um eventuell einen Fehler zu finden woran es liegen könnte . Habe ein PDF für cephis in dem das Medium  1/3 für cephys genutzt wird. Zudem liegen diese Gläser fast 4 Monate zurück wo ich dein Medium für meine ersten Versuche genutzt habe  wenn ich weiss das Keimung und das Sterile alles funktioniert dann kann ich bei den nächsten Gläsern einen Hochwertigen nährboden schaffen. Die Keimung hat ja in erster Linie nichts damit zu tun wieviel ms ich genutzt habe. Wenn das explantat nach 2 Tagen beginnt schwarz zu werden liegen die Fehler sicherlich (zumindest dachte ich das) nicht am Medium sondern an meiner Vorgehensweise,  da ich nicht unzählige Rohstoffe verschwenden möchte, mache ich die nährmedien mit weniger ms das gibt mir mehr Zeit um meine Abläufe das sterilisieren der explantate und co zu optimieren, wenn das besser funktioniert bin ich auch bereit mit mehr MS zu arbeiten. Hätte ich immer mit der vorgeschlagenen Menge gearbeitet hätte ich schon sehr viel MS weg geschmissen, jedoch ist mein Gedanke, ich kann sie ja auch wenig ms zum keimen bringen und wenn mir danach ist sie auf ein vernünftiges für sie geeignetes Medium Umsiedeln.  Im Prinzip interessiert mich aber nur cephalotus, die anderen Gläser entstehen nur weil ich nährmedium übrig habe und ein Überschuss an Samen übrig habe. Meine Frage war auch nicht ob mir jemand helfen kann, wollte eigentlich nur wissen ob sowas vll öfter mal vorkommt oder ob es vll daran lag das das Saatgut schon alt war. Aber zu sagen das ich mir alles an den arsch tragen lasse, ist schlichtweg falsch, denn ich beschäftige mich sehr viel damit wollte lediglich auch nur etwas hier aktiv sein. So und wenn die 2 anderen Gläser nicht auch schön wachsen würden hätte ich mir auch Gedanken um das Medium gemacht, wenn aber 2 Gläser schön wachsen, dann kann es ja nicht grundsätzlich falsch sein und andere Gründe sollte es dafür geben. Klar sind meine Abläufe nicht korrekt,  da ich das alles auch in einer Box mache und in vielen Dingen improvisieren, deswegen erwarte ich auch kein perfektes Ergebnis. Und wie man das nährmedium aufkochen oder ob man es mehrmals aufkochen kann, auch damit habe ich mich auseinander gesetzt deswegen ist auch das nicht grundsätzlich falsch nur eben nicht optimal, nach dem anrühren kommen die behälter in spezielle Tüten die versiegelt sind bis zu ihrem Einsatz und da ist das steriliesieren erstmal leichter wenn es vorher schon geliebt war das ich bestimmte Positionen im Topf nutzen kann bis es wieder flüssig wird. Das gelieren hat nur deswegen nicht funktioniert weil 85grad (wie im Netz beschrieben für dieses agar nicht ausgereicht haben bei 95 grad hat es problemlos funktioniert und bei meinem vorherigen magnetrührer hat es auch schon bei 85grad funktioert. Da die aktivkohle neu hinzu kam war für mich erstmal das der grund , Klar ist das problem des aushärten für mich nun gelöst.

Nichtsdestotrotz wenn alles andere richtig funktioniert dann mach ich mir um die angepassten nährmedien gedanken, solange die explantate nach wenigen tage schon tot sind , wegen zu langem sterilisieren und co,  brauche ich mir über eine Abstimmung der nährmedien noch keine Gedanken machen, für mich sind das lediglich Versuche.

Ich hab auch schon andere nährmedien ohne erfolg gekocht, die sehenden Gläsern sind meine alle ersten Versuche aus dem Mai, und klar habe ich den Biden schon in Betracht gezogen das klärt aber nicht die frage warum 2 anderen Gläser aus der gleichen Charge gut aussehen, und wenn ich mir ein PDF durchlese kann ich da numal kei. Bild hoch laden oder der der es geschrieben hat in kontakt treten.

Tatsächlich finde ich diese Unterstellung schon irgendwie frech, denn ich beschäftige mich recht viel mit dem Thema. 

[Tobias Kulig]

Ich bin dann raus aus der Nummer…

[Oli C.]

Hallo zusammen,

 

ich würde den pH-Wert deines Mediums nicht so tief ansetzen. Ab 5.5 und tiefer wird Agar nicht mehr richtig feste. Du arbeitest zwar mit einem pH von 5.65, aber Du solltest im Hinterkopf behalten, dass Du wahrscheinlich nicht genau den pH messen kannst. pH-Geräte für 100€ oder etwas mehr sind da auch nicht viel besser. An deiner Stelle würde ich versuchen, den pH etwas höher anzusetzen. Ich arbeite zur Zeit mit Rhododendren, die es auch saurer mögen als viele andere Pflanzen, aber denen scheinen Schwankungen (insbesondere nach oben) nicht sehr viel auszumachen. Hier gebe ich Dir noch einen Link mit (siehe unten), der zeigt, dass größere pH Schwankungen Äpfeln in der TC keine Probleme bereiten. Karnivoren sind da spezieller, ich weiß, aber wenn du mal 5.7 bis 5.9 ausprobieren solltest, würde ich gerne glauben, dass das ebenfalls funktionieren wird.

 

Wenn deine Samen oder Explantate im Medium schwarz werden, sind das keine Kontaminationen. Wenn da etwas kontaminiert ist, bildet sich ab dem Moment, in dem es besorgniserregend aussieht (teilweise sehen die 5 Tage gut aus und dann werden sie schlecht - Stichwort Endoparasiten, wobei ich dazu nichts weiß) innerhalb weniger Tage ein großer Film. Ich würde sowas dann mal einen oder zwei Tage länger beobachten und wenn sich kein Flaum bildet, ist es keine Konti. Kleiner Tip (deshalb arbeite ich mit Plastik, weil man es wegschmeißen kann und es unter anderem auch nicht im- bzw. explodieren kann wie Glas), wenn Du eine Konti hast, dann öffne das Ding nur nach langem sterilisieren oder schmeiß es weg. Wenn man das so öffnet holt man sich einfach viel zu viele Sporen in die Umgebung. Gesundheitlich nicht sehr schön und für die TC sind das dann eventuell große Kopfschmerzen mit zukünftigen Projekten...

 

Aber ich glaube, phenolic browning ist hier schon mal irgendwo gefallen. Ich habe letztens einige Versuche gemacht und ich kann Ascorbinsäure aka. Vitamin C in Kombination mit Dunkelheit empfehlen. Nach dem Sterilisieren einfach die Explantate statt mit sterilem Wasser in einer sterilen Vitamin C Lösung 1g/L waschen. Man kann Ascorbinsäure günstig als Pulver in der Apotheke beziehen, aber ich hab noch Tabletten irgendwo mit Vitamin C gefunden und das geht auch. Danach wurden die 48h dunkel gestellt. Ich hab zum Vergleich auch einige Explantate ohne Ascorbinsäure gespült, nur mit Wasser, aber ebenfalls dunkel gestellt und naja, ich bin mir nicht sicher, ob die das phenolic browning überleben. Umsetzen werde ich sie nicht, da ich das Experiment genau deshalb gemachr habe. Ich kann ja morgen ein Bild mit Vergleichen schicken.

 

Tissue Culture ist nicht ganz einfach und schon ein wenig komplex. Es ist nicht schwer, man muss aber herumprobieren. Egal ob du eine laminar flow hood hast oder nicht. Jede Pflanze reagiert etwas anderes und darüber hinaus gibt es echt viele Möglichkeiten etwas zu machen und darunter oft auch mehrere Möglichkeiten etwas richtig zu machen. Wenn Du nicht sofort aufgibst, wird das definitiv etwas. Nimm Dir einen Cephalotus der möglicherweise nicht allzu besonders ist und den Du in Massen da hast und mach einfach einige Experimente und vergleiche mal. Vergiss bitte nicht, dass auch professionelle Labore bei neuen Pflanzen ihr Prozedere überdenken müssen. Es gibt nicht um sonst Studien, die für jede Gattung oder sogar Art, die kommerziell interessant wird, untersuchen, welche Medienzusammensetzungen und Sterilisationsmethoden sowie anderes für diese spezifischen Arten am besten funktionieren. TC ist auch in der professionellen Welt oft trial and error.

 

Gutes Gelingen

Oliver

 

 

 

Edit: Link der Studie vergessen

 

https://journals.ashs.org/hortsci/view/journals/hortsci/52/3/article-p475.xml

Bearbeitet 27. August 2023 von Oli C.

[Oli C.]

Hier die erwähnten Bilder. Die drei links sind mit normalen Wasser gespült worden und rechts mit Vitamin C wie oben beschrieben. Mitte Links ist auch eine Kontamination dabei, wie ich gerade feststellen konnte.

 

 

 

 

[crash]

 

Zitat

ich würde den pH-Wert deines Mediums nicht so tief ansetzen. Ab 5.5 und tiefer wird Agar nicht mehr richtig feste. Du arbeitest zwar mit einem pH von 5.65, aber Du solltest im Hinterkopf behalten, dass Du wahrscheinlich nicht genau den pH messen kannst. pH-Geräte für 100€ oder etwas mehr sind da auch nicht viel besser. An deiner Stelle würde ich versuchen, den pH etwas höher anzusetzen. Ich arbeite zur Zeit mit Rhododendren, die es auch saurer mögen als viele andere Pflanzen, aber denen scheinen Schwankungen (insbesondere nach oben) nicht sehr viel auszumachen. Hier gebe ich Dir noch einen Link mit (siehe unten), der zeigt, dass größere pH Schwankungen Äpfeln in der TC keine Probleme bereiten. Karnivoren sind da spezieller, ich weiß, aber wenn du mal 5.7 bis 5.9 ausprobieren solltest, würde ich gerne glauben, dass das ebenfalls funktionieren wird.

 

Wenn deine Samen oder Explantate im Medium schwarz werden, sind das keine Kontaminationen. Wenn da etwas kontaminiert ist, bildet sich ab dem Moment, in dem es besorgniserregend aussieht (teilweise sehen die 5 Tage gut aus und dann werden sie schlecht - Stichwort Endoparasiten, wobei ich dazu nichts weiß) innerhalb weniger Tage ein großer Film. Ich würde sowas dann mal einen oder zwei Tage länger beobachten und wenn sich kein Flaum bildet, ist es keine Konti. Kleiner Tip (deshalb arbeite ich mit Plastik, weil man es wegschmeißen kann und es unter anderem auch nicht im- bzw. explodieren kann wie Glas), wenn Du eine Konti hast, dann öffne das Ding nur nach langem sterilisieren oder schmeiß es weg. Wenn man das so öffnet holt man sich einfach viel zu viele Sporen in die Umgebung. Gesundheitlich nicht sehr schön und für die TC sind das dann eventuell große Kopfschmerzen mit zukünftigen Projekten...

 

Aber ich glaube, phenolic browning ist hier schon mal irgendwo gefallen. Ich habe letztens einige Versuche gemacht und ich kann Ascorbinsäure aka. Vitamin C in Kombination mit Dunkelheit empfehlen. Nach dem Sterilisieren einfach die Explantate statt mit sterilem Wasser in einer sterilen Vitamin C Lösung 1g/L waschen. Man kann Ascorbinsäure günstig als Pulver in der Apotheke beziehen, aber ich hab noch Tabletten irgendwo mit Vitamin C gefunden und das geht auch. Danach wurden die 48h dunkel gestellt. Ich hab zum Vergleich auch einige Explantate ohne Ascorbinsäure gespült, nur mit Wasser, aber ebenfalls dunkel gestellt und naja, ich bin mir nicht sicher, ob die das phenolic browning überleben. Umsetzen werde ich sie nicht, da ich das Experiment genau deshalb gemachr habe. Ich kann ja morgen ein Bild mit Vergleichen schicken.

 

Tissue Culture ist nicht ganz einfach und schon ein wenig komplex. Es ist nicht schwer, man muss aber herumprobieren. Egal ob du eine laminar flow hood hast oder nicht. Jede Pflanze reagiert etwas anderes und darüber hinaus gibt es echt viele Möglichkeiten etwas zu machen und darunter oft auch mehrere Möglichkeiten etwas richtig zu machen. Wenn Du nicht sofort aufgibst, wird das definitiv etwas. Nimm Dir einen Cephalotus der möglicherweise nicht allzu besonders ist und den Du in Massen da hast und mach einfach einige Experimente und vergleiche mal. Vergiss bitte nicht, dass auch professionelle Labore bei neuen Pflanzen ihr Prozedere überdenken müssen. Es gibt nicht um sonst Studien, die für jede Gattung oder sogar Art, die kommerziell interessant wird, untersuchen, welche Medienzusammensetzungen und Sterilisationsmethoden sowie anderes für diese spezifischen Arten am besten funktionieren. TC ist auch in der professionellen Welt oft trial and error.

 

Super vielen liebe Dank für deine aufbauenden Worte, und du hast volkommen recht, es gibt mehrere Möglichkeiten die Dinge richtig zu machen.

Ich mein Samen Funktionieren Problemlos ohne Kontis, aber an dem Cephalotus beis ich mir noch die Zähne aus, aber wir tasten uns dran. Aktuell nutze ich VitaminC direkt im Medium, 0,01mg auf 1L

 

Mittlerweile Gabs bei mir auch ein Upgrade mit einem Ulpa Filter, jetzt kann es auch mit der Pilzzucht weiter gehen. Ein voll funktionsfähiger Autoklav und Glasperlensterilisator ist auch dazu gekommen. Jedoch probiere ich den Autoklav wieder los zu werden, auch wenn der Autoklav platz für 18,7l hat, ist das Innenleben für größere Behälter viel zu klein und unpraktisch. Da war ich mit meinem Dampfdruckkochtopf besser bedient, und da werde ich mir einen größeren 10l+ hole.

 

Die Acrylglas Platten sind nur mit Klettverschluss angebracht, das ein Abbauen unproblematisch ist, Der Raum ist dadurch zwar nicht 100% geschützt aber für meine Bedürfnisse langt es, und Kontis hatte ich bis dato auch noch keine. Der Filter läuft so gut das egal wo ich im ganzen Raum Petris für 30Min offen stehen hatte, auch diese Konti frei bleiben, das hatte mich schon schwer beeindruckt. Jedenfalls danke ich dir für das Teilen deines Experimentes  und die offenen Worte ohne ein Geheimnis daraus zu machen, oder das Zeug der anderen schlecht zu reden (das scheint wohl normal in diesem Hobby zu sein) dabei gibt es soviele Möglichkeiten.

 

LG Crash

Bearbeitet 4. November 2023 von crash

[Andreas Wistuba]

vor 5 Stunden schrieb crash:

 

 

Mittlerweile Gabs bei mir auch ein Upgrade mit einem Ulpa Filter, jetzt kann es auch mit der Pilzzucht weiter gehen. Ein voll funktionsfähiger Autoklav und Glasperlensterilisator ist auch dazu gekommen. Jedoch probiere ich den Autoklav wieder los zu werden, auch wenn der Autoklav platz für 18,7l hat, ist das Innenleben für größere Behälter viel zu klein und unpraktisch. Da war ich mit meinem Dampfdruckkochtopf besser bedient, und da werde ich mir einen größeren 10l+ hole.

 

 

 

Diese Mini-Autoklaven, die's massenhaft auf eBay gibt, sind gar nicht für Flüssigkeiten gedacht sondern für Arzt-Besteck.

Mich wundert immer, dass das überhaupt funktioniert.

Für Flüssigkeiten bist Du für Kleinmengen mit einem großen Dampfdruck-Topf besser bedient.

Grüße
Andreas

 

[Oli C.]

Cool zu sehen, dass Du expandiert hast! Ich wünsche Dir viel Erfolg und teil deinen Erfolg gerne mit uns. Ich wäre interessiert.

 

Ja, es gibt unglaublich viele Möglichkeiten, Tissue Culture bzw. Pilzzucht zu betreiben. Da reicht eine kleine Google Suche, um das zu merken.

 

Das schöne an einer Laminar Flow Hood ist aber einfach, dass man sehr spontan arbeiten kann. Eine SAB braucht einfach eben die 30Min Standzeit nach dem ausgiebigen Desinfizieren. Man muss Bewegungen so gut es geht vermeiden etc. Umständlich ist das teilweise schon, aber eben nicht unmöglich.

 

Gruß

Oliver

[crash]

Am 4.11.2023 um 08:51 schrieb Andreas Wistuba:

Diese Mini-Autoklaven, die's massenhaft auf eBay gibt, sind gar nicht für Flüssigkeiten gedacht sondern für Arzt-Besteck.

Mich wundert immer, dass das überhaupt funktioniert.

Für Flüssigkeiten bist Du für Kleinmengen mit einem großen Dampfdruck-Topf besser bedient.

Grüße
Andreas

Da kann ich dir allerdings nicht wiedersprechen, funktionieren tut es, der 23er 18,7L ist nicht unbedingt klein, aber ein großer runder würde ich nun auch bevorzugen. Manche Sachen mache ich auch noch im ddkt. Hab auch schon probiert ein Abnehmer dafür zu finden um mir einen einen anderen großen zu holen, da ich auch gerne pilz substratsäcke autoklaviren würde. Aber vielen Dank für den Hinweis 

[Tobias Kulig]

Am 4.11.2023 um 08:51 schrieb Andreas Wistuba:

Mich wundert immer, dass das überhaupt funktioniert.

Das diese Melaggeräte nicht für Flüssigkeiten geeignet sind, steht sogar ausdrücklich in der Betriebsanleitung! 
Trotzdem funktioniert es bestens. Warum auch nicht? Man hat 121 Grad, 1 bar Druck und ne Zeitschaltuhr. Man sollte nur die maximale Beladungskapazität nicht überschreiten. Und da ist man mit den paar Gläsern mit Medium noch gut drunter. Ich verwende diese Geräte schon seit ich invitro mache.

 

Und Kleinmengen sind eine Definitionssache. In mein aktuelles Gerät passen 10 Gläser mit 82mm Deckel und 13cm Höhe oder ca. 18 Babygläser mit Magenta B Caps. Als "Kleinmenge" völlig ausreichend, zumal ich das ja nur hobbymässig betreibe.

[Andreas Wistuba]

vor 12 Minuten schrieb Tobias Kulig:

Das diese Melaggeräte nicht für Flüssigkeiten geeignet sind, steht sogar ausdrücklich in der Betriebsanleitung! 
Trotzdem funktioniert es bestens. Warum auch nicht? Man hat 121 Grad, 1 bar Druck und ne Zeitschaltuhr. Man sollte nur die maximale Beladungskapazität nicht überschreiten. Und da ist man mit den paar Gläsern mit Medium noch gut drunter. Ich verwende diese Geräte schon seit ich invitro mache.

Naja, Du hast keine Kontrolle über den Temperaturverlauf im Medium. Deine Zeit läuft, wenn der Wasserdampf 1 Bar Überdruck hat oder 121°C.
Ein Autoklav für Flüssigkeiten hat einen Messfühler in einer Referenzflasche und misst so die tatsächlichen Verhältnisse in einem entsprechenden Flüssigkeitsvolumen.
Das ist viel genauer und Du kannst die Sterilisation genau so einstellen, dass Du weder Agar, noch Vitamine etc. kaputt kochst. Außerdem haben viele Geräte (meiner z.B.) eine Rückkühlung und Stützdruck, was auch hilft, die Medien möglichst schonend zu autoklavieren und Zeit zu sparen.

Und ich wüsste auch nicht, wie ich Literflaschen in einen Melag Besteck-Autoklav bekommen soll. Geschweige denn 16 Stück davon - mein normaler Ansatz.
Grüße
Andreas

Bearbeitet 10. November 2023 von Andreas Wistuba

[Tobias Kulig]

vor 22 Minuten schrieb Andreas Wistuba:

Naja, Du hast keine Kontrolle über den Temperaturverlauf im Medium. Deine Zeit läuft, wenn der Wasserdampf 1 Bar Überdruck hat oder 121°C.
Ein Autoklav für Flüssigkeiten hat einen Messfühler in einer Referenzflasche und misst so die tatsächlichen Verhältnisse in einem entsprechenden Flüssigkeitsvolumen.
Das ist viel genauer und Du kannst die Sterilisation genau so einstellen, dass Du weder Agar, noch Vitamine etc. kaputt kochst.

Ah, ich verstehe, was Du meinst. Da hast Du recht, das hat ein Melag natürlich nicht. Aber ich denke, das brauche ich auch nicht bei der Mindermenge pro Glas. Ich weiß ja, daß es passt.

Bei ein paar Litern pro Charge, wie bei Dir, macht das natürlich Sinn. 

 

vor 37 Minuten schrieb Andreas Wistuba:

Außerdem haben viele Geräte (meiner z.B.) eine Rückkühlung und Stützdruck, was auch hilft, die Medien möglichst schonend zu autoklavieren und Zeit zu sparen.

Das hat mein aktueller Melag aber auch...

 

vor 38 Minuten schrieb Andreas Wistuba:

Und ich wüsste auch nicht, wie ich Literflaschen in einen Melag Besteck-Autoklav bekommen soll. Geschweige denn 16 Stück davon - mein normaler Ansatz.

Ich komm mal mit meinem Gerät vorbei, das kriegen wir hin...