InVitro Hilfe!

[Florian S.]

Hallo zusammen,

 

habe einen InVitro Versuch gestartet aber bin angesichts der Entwicklung meiner Explantate doch enttäuscht.. Die Kulturen stehen nun ca. 14 Tage. Alle Explantate haben schwarz abgestorbene Schnittstellen, obwohl ich nach dem Sterilisieren die Enden noch abgetrennt hatte.

Woran kann das liegen? Besteht da noch Chance oder sollte ich umsetzen und die schwarzen Enden erneut zurückschneiden?

 

LG, Florian

Bearbeitet 6. Mai 2015 von Florian S.

[Manuel Christ]

Hallo Florian,

die Explantate schauen in der Tat nicht besonders gut aus.

Ich schneide die Enden nach dem Sterilisieren großzügig ab, bis das Explantat maximal 1 cm in der Länge misst. Damit bekommt man nebenbei eine kleinere Oberfläche und die Kontaminationsquote sinkt auch.

Wie lautet dein Sterilisationsprotokoll und welches Medium hast du verwendet?

Übrigens liegt das Dionaea-Blütenstück relativ tief im Medium. Die besten Resultate habe ich erzielt, wenn man es nur auf das Medium legt.

Viele Grüße,

Manuel

Bearbeitet 7. Mai 2015 von Manuel Reimansteiner

[Andreas Wistuba]

Hallo zusammen,

 

habe einen InVitro Versuch gestartet aber bin angesichts der Entwicklung meiner Explantate doch enttäuscht.. Die Kulturen stehen nun ca. 14 Tage. Alle Explantate haben schwarz abgestorbene Schnittstellen, obwohl ich nach dem Sterilisieren die Enden noch abgetrennt hatte.

Woran kann das liegen? Besteht da noch Chance oder sollte ich umsetzen und die schwarzen Enden erneut zurückschneiden?

 

LG, Florian

 

 

Hallo Florian,

ohne irgendwelche Informationen wird Dir kaum jemand sinnvoll antworten können.

Du schreibst weder was das ist (Gattung) noch worin das liegt (Medium) noch was Du damit gemacht hast (Sterilisationstechnik) noch, wie Du das Unbekannte Stück kultivierst.

Grüße

Andreas

[Florian S.]

Hallo Florian,

die Explantate schauen in der Tat nicht besonders gut aus.

Ich schneide die Enden nach dem Sterilisieren großzügig ab, bis das Explantat maximal 1 cm in der Länge misst. Damit bekommt man nebenbei eine kleinere Oberfläche und die Kontaminationsquote sinkt auch.

Wie lautet dein Sterilisationsprotokoll und welches Medium hast du verwendet?

Übrigens liegt das Dionaea-Blütenstück relativ tief im Medium. Die besten Resultate habe ich erzielt, wenn man es nur auf das Medium legt.

Viele Grüße,

Manuel

 

Danke ersteinmal! Es handelt sich, wie du schon erkannt hast, um einen Dionaeablütenstiel. Als Medium habe ich 1/3MS, 1mgBAP, 100%MS Vitamine, 4g Agar , 1,5ml PPM, und 20g Saccharose verwendet.(1Liter Medium)

 

Mein Sterilisationsprotokoll lautet wie folgt.

 

30sek 70% Ethanol

 

Variante 1) 3% NaOCl für 5min, Spülen

Variante 2) 1g/L NaDCC 5min, kein Spülen

 

Kontaminationen habe ich zwar keine einzige, aber durch den PPM Gebrauch scheinen mir die Explantate im Medium auch weiterhin zu leiden.

 

Ich habe gestern einige Gläser geöffnet und die schwarzen Enden abgetrennt, heute Abend waren sie bereits wieder schwarz. Zu viel PPM auf jeden Fall, oder?

Du sagst, die besten Ergebinnse erzielst du, wenn das Explantat nur oben aufliegt. Dann werde ich das beim nächsten Mal probieren, diesmal ist durch die geringe Agarmenge das Medium zu weich dafür. -_-

 

Die Kulturen stehen bei Zimmertemperatur (20-22°C) unter 960er LSR 15Std Licht/Tag.

 

 

LG, Florian

Bearbeitet 14. Mai 2015 von Florian S.

[Manuel Christ]

Hallo Florian,

das Medium schaut so weit für die Kallusbimdung gut aus.

1,5 ml PPM sind gar kein Problem für Dionaea, ich glaube es liegt an deinen Sterilisationsverfahren.

30 sek 70% iges Ethanol ist recht hart für pflanzliche Zellen, der Ethanolschritt vor der eigentlichen Sterilisation wird nur angewendet um Explantate zu benetzen (1 sek reicht aus) und eine gute (spätere) Sterilisation zu gewährleisten.

Deine 1. Variante passt soweit, da kannst du sogar ruhig auch auf bis zu 5% NaOCl gehen.

Beim Einsatz von NaDCC solltest du unbedingt die Explantate danach mehrmals spülen, die Chlorverbindungen sind recht aggressiv ...

Beleuchten musst du Kalluskulturen übrigens nicht, da undifferenziertes Zellgewebe keine Photosynthese betreibt. Außerdem bekommt man ohne Licht schön reinweiße Kalli, die sich perfekt zur Weiterkultur eignen.

Viele Grüße,

Manuel

[Florian S.]

Danke für die rasche Antwort. Ich habe gelesen, dass nach der NaDDC-Sterilisation eben gar kein Spülen nötig sei..

 

Nagut, dann werde ich diese Tipps umsetzen. Weniger Zeit im Ethanol und kräftigeres Spülen. Bisher habe ich das Material lediglich von der Sterilisationslösung raus in steriles Wasser gelegt und das Becherglas wenige Sekunden geschaukelt, dann das Material wieder entnommen. Vermutlich war das kein Spülen im eigentlichen Sinn, oder?

 

Kurz zum Licht. Eine Beleuchtung ist also solange vollkommen überflüssig, wie ich keine Ausdifferenzierung habe? Es spielt also keine Rolle ob die Kulturen in völliger Dunkelheit stehen?

Die Temperatur von ca. 20°C ist aber ausreichend?

 

LG, Florian

Bearbeitet 14. Mai 2015 von Florian S.

[Florian S.]

Einige Zeit ist vergangen, einiges an Kompost habe ich produziert. Nun sehe ich das hier...

 

Ist das ein Kallus? Ich dachte zunächst, dass es sich um einen Pilz handelt, habe das Glas beiseite gestellt und heute wollte ich es entfernen und habe mal genauer hingeschaut. Da es kaum mehr Licht bekam, ist dieser Klumpen gräulich/weiss geblieben.

Ich weiß, das Bild ist nicht sehr aussagekräftig. Auf der Blattunterseite ist ähnliche Gewebebildung an selber Stelle wie auf der Oberseite.

 

Wenn es ein Kallus ist, was mache ich nun? Auf hormonfreies Medium umsetzen oder auf eines mit Auxinen? Wenn ja welche Konzentration sollte ich nehmen? Im Moment befindet sich der Kallus auf 1/3 MS mit 2mg BAP.

 

LG, Florian

[Thomas M.]

Kann da niemand was zu sagen?

[Florian S.]

mal ein kleines Update. Sieht schon ganz gut aus

[Tina]

Hi Flo,

super ich gratuliere dir zu deinem Erfolg :bow:

Jetzt machst du dich hoffentlich über die Cephis In Vitro her will ich hoffen. :crazy:

[Florian S.]

Hi Flo,

super ich gratuliere dir zu deinem Erfolg :bow:

Jetzt machst du dich hoffentlich über die Cephis In Vitro her will ich hoffen. :crazy:

Psschhhht!

[Tina]

ha,ha,ha, :lol:

[Thomas M.]

Super Florian! Was sind das für VFF Klone auf den Bildern? Es trägt ja langsam Früchte!

Thomas

Bearbeitet 17. August 2015 von Thomas M.

[Florian S.]

Es sind 'Alien' und 'SharkTeeth x Dentata'

[Lukas H.]

Hallo Florian,

Wie sehen deine Kulturen mittlerweile aus ? Ein Update wäre sehr interessant

Gruss Lukas

[Florian S.]

Och es klappt ganz gut Habe ein paar Bilder angehängt, Reihenfolge entspricht der Auflistung:

D. californica

D.m. Louchapates

D. regia

P. lusitanica

D.m. SharkTeeth x Dentata

[Lukas H.]

Sieht wirklich sehr vielversprechend aus

Benutzt du noch PPM ?

[Tina]

Hallo Flo,

 

das sieht echt gut aus. Gratuliere dir. :bow:

Wann machste nen Cephi ? ............. :getdown:

[Florian S.]

Danke

Nein, PPM nutze ich nicht mehr. Habe eine Sterilbank das genügt.

Cephalotus habe ich auch Nur nicht mitfotografiert. Allerdings bisher nur aus Samen, aus Blättern habe ich noch Probleme mit phenolischem Bluten

LG, Flo

[Gast]

Was zum Kuckuck sind phenolische Blüten?

 

Wenn ich das google, finde ich Rezepte für Maibowle mit Waldmeister oder Artikel über Phenole in Wein.

Bearbeitet 1. Dezember 2015 von Wolfgang Liere

[Nicky Westphal]

 phenolisches Bluten, nicht Blüten

[Florian S.]

Phenolische Blüten kenne ich auch nicht, davon war aber auch nicht die Rede

Allerdings findet sich nur unter dem englischen "phenolic bleeding" eine Erklärung.

Es handelt sich um eine Stressreaktion der Pflanze, die dabei phenolische Verbindungen ausscheidet und ohne "Behandlung" das Invitromaterial dabei zerstört wird.

[Lukas H.]

Alles klar sieht bei mir genauso aus

Bei mir sind mittlerweile auch die ersten Ceph Samen gekeimt.

Habe gehört das man bei Cephs allgemein Probleme hat mit phenolic bleeding halt dann auch beim subculturing...naja mal schauen wie es klappen wird

Gruss Lukas

[Florian S.]

Ja wenn es bei dir auch so aus sieht lass' mal Bilder von dir sehen! Also von deinen Kulturen..

[Lukas H.]

Ja werd ich bestimmt machen

Sieht nur noch nicht so interessant aus wie deine! Sind eigentlich alle erst gekeimt und kallis haben sich auch noch nicht wirklich grossartig gebildet hab den Dreh erst so richtig seit kurzem raus.

Vorher viel Biomüll produziert aber das is ja normal :'D