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In-Vitro-kultur (Bachelorarbeit)


Mightymaster

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Mightymaster

Hi Leute

ist schon ne Weile her seit ich das letzte mal hier im Forum aktiv war ...zu lange :wacko:

Ich wollt nur mal berichten, dass ich mein Wunschthema für meine Bachelorarbeit bekommen hab: "In-Vitro-kultur von Karnivoren"

Meine Aufgabe wird es sein, dass richtige Medium zu erstellen und die anschließende Akklimatisierung zu optimieren. Ich hab als Art Dionaea muscipula (normale und rote Sorte). Dauert aber noch, bis es los geht. Erstmal muss ich da analytisch rangehen und schon publizierte arbeiten "zusammensuchen" um die ersten theoretischen Ansätze zu machen. Dann im August oder so gehts ab ins Labor ;)

Werd das hier, wenns was Neues gibt, aktualisieren und euch auf dem neuesten Stand halten

bis denn :cool:

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Andreas Wistuba

Herzlichen Glückwunsch und viel Erfolg!

Viel ist zu Dionaea übrigens nicht publiziert. Da gibt's sicherlich noch einiges zu tun.

Viele Grüße

Andreas

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Gratulation zu diesem schönen Thema...

Bei uns an der Uni (TU DD) ist zu diesem Themengebiet leider nichts zu holen. Da bin ich schon ein bisschen neidisch - und vor allem gespannt was raus kommt.

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Gluckwunsch. Da haste ne gute Wahl getroffen.

VFF sind sehr einfach. Kultiviere diese seid Jahren in-vitro mit eigens entwickelten medien...

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Hallo,

da muß ich jetzt aber mal Fragen, wozu dieser ganze Aufwand? Einfach 1/2 MS nehmen und gut ist's. Da wachsen sie wie von ganz allein. Müssen nur noch die äußeren Bedingungen (wie Licht und Temperatur) stimmen!

Dazu kann man auch was in der Literatur finden!

Und falls es mehr in Richtung Kalluskultur gehen soll, gab es vor einiger Zeit sogar mal einen Beitrag dazu im Taublatt. Es war, glaube ich, sogar die VVF dabei.

Schau doch erstmal in die Literatur, was in dieser Richtung bereits alles veröffentlicht ist und leg dich danach auf eine Art bzw. eine Richtung fest, in die es gehen soll.

Mit Dionaea kann man jedenfalls keinen Blumentopf mehr gewinnen ;)

Viele Grüße

Henry

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Mightymaster

naja ich will ja das optimale Medium inklusive Phytohormone etc. herausfinden. Also die effizienteste Anzuchtmethode (inklusive Kostenkalkulation) Werde wohl so einige Versuchreihen ansetzen. Werd mich dann bald mal daran machen infos zu sammeln aber zunächst haben einige Klausuren Vorrang :)

Edit: vielleicht kann ich ja auch einige Pflänzchen mitnehmen :P

Edited by Mightymaster
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Andreas Wistuba

Hallo,

da muß ich jetzt aber mal Fragen, wozu dieser ganze Aufwand? Einfach 1/2 MS nehmen und gut ist's. Da wachsen sie wie von ganz allein. Müssen nur noch die äußeren Bedingungen (wie Licht und Temperatur) stimmen!

Dazu kann man auch was in der Literatur finden!

Und falls es mehr in Richtung Kalluskultur gehen soll, gab es vor einiger Zeit sogar mal einen Beitrag dazu im Taublatt. Es war, glaube ich, sogar die VVF dabei.

Schau doch erstmal in die Literatur, was in dieser Richtung bereits alles veröffentlicht ist und leg dich danach auf eine Art bzw. eine Richtung fest, in die es gehen soll.

Mit Dionaea kann man jedenfalls keinen Blumentopf mehr gewinnen ;)

Viele Grüße

Henry

MS ist ein Tabakmedium. Die Tatsache, dass (fast) jeder MS verwendet, kommt daher, dass (fast) jeder es verwendet...

Die Literatur ist voll mit MS Protokollen, jeder meint wenn das so ist, muss es ja DAS Medium sein und wieder gibt es ein MS-Protokoll mehr...

Herdentrieb eben...

Ich gebe hier sicher keine Rezepte heraus, die ich langwierig herausgetüftelt habe. Das sind Betriebsgeheimnisse.

Nur soviel: Ohne grössere Modifikationen verwende ich MS gar nicht mehr.

Grüße

Andreas

Edited by Andreas Wistuba
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Hört sich wirklich spannend an.

Ich wünsche dir eine produktive Zeit ;)

Darfst du so einfach deine Recherchen / Bachelorarbeitauszüge ins Forum stellen?

Würde da eher etwas aufpassen.

Vielleicht bringt dich die In-Vitro-Kultur bei Orchideen auf die richtige Spur, wenn es bei Karnivoren so wenig Ansätze zu finden sind.

Würde mich freuen, über deine Arbeit in einiger Zeit mehr zu erfahren (soweit es erlaubt ist).

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Mightymaster

Danke :)

ja werd da nochmal nachfragen, wie das so mit dem veröffentlichen ist. Hoffe das geht in ordnung

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Hi,

das hört sich nach einem echt interesanten Thema, das würd ich auch sofort machen wenn ichs kriegen könnte! Was studierst du den genau??

Lg, Eva

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Muste zwar erst googeln, aber hört sich interesant an. Scheint ja auch einige paralellen zum Gartenbau zu geben!

Lg, Eva

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Mightymaster

ja genau....die ersten beiden Semester sind fast identisch mit Gartenbau :)

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  • 3 weeks later...

Hallo,

ich seh das ein bißchen anders:

MS nehmen viele, weil es für vieles funktioniert, nicht nur für Tabak, u.a. eben auch für Dionaea - und weil es ein einfaches Rezept/ einfach herzustellen ist.

Nur weil es jemandem persönlich nicht "schmeckt" bzw. nicht die erwarteten Resultate liefert, muß es noch lange nicht schlecht sein. Und wenn man mal die dazu publizierte Literatur studiert, wird man feststellen, das MS im Vergleich mit anderen untersuchten Medien im Bezug auf die Fragestellung meist besser abschneidet! So viel zu

muss es ja DAS Medium sein
und
Herdentrieb eben...

Zudem sage ich ja auch nicht, daß MS das "Allheilmittel" wäre und es nichts zu verbessern gäbe! Bei mir funktioniert MS auch nicht für alles, obwohl es entsprechende Protokolle dafür in der Fachliteratur gibt. Es hängt eben nicht nur vom ausgewählten Medium ab, sondern auch von den herrschenden Umgebungsbedingungen. Es gibt halt zwei Seiten, die man steuern kann, um eine erfolgreiche Kultur zu erreichen.

Ich wollte eigentlich auch gar nicht auf das Nährmedium oder die gewählte Art für die Untersuchungen zur iv-Kultur abzielen, sondern eher auf die Herangehensweise. Aber da es sich um eine Bachelorarbeit handelt, kann man daß natürlich noch so machen.

Viele Grüße

Henry

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Hi,

das hört sich ja sehr interessant an, da ich meine Arbeit auch mit Dionaea (sprich weiteren Vertretern in den Caryophyllales, wie Nepenthes und Drosera) mache. Bei mir geht es jedoch um die "Immunantwort" der Karnivoren. Für einen Essay muss ich auch eine in-vitro Kultur ansetzen - jedoch reicht mir da die Keimung der Samen schon völlig aus.

Ich stehe nämlich vor dem gleichen Problem, dass zu Dionaea und Co. noch nicht viele Paper vorhanden sind - für weitere Infos in diesem Beitrag wäre ich also auch sehr dankbar!!

Viele Grüsse

Marc

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Ich nehme auch schon seit Jahren MS Media fuer VFF. Leicht modifiziert mit LS Vitaminen und das klappt super klasse.

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  • 2 weeks later...

Hi,

das hört sich ja sehr interessant an, da ich meine Arbeit auch mit Dionaea (sprich weiteren Vertretern in den Caryophyllales, wie Nepenthes und Drosera) mache. Bei mir geht es jedoch um die "Immunantwort" der Karnivoren. Für einen Essay muss ich auch eine in-vitro Kultur ansetzen - jedoch reicht mir da die Keimung der Samen schon völlig aus.

Ich stehe nämlich vor dem gleichen Problem, dass zu Dionaea und Co. noch nicht viele Paper vorhanden sind - für weitere Infos in diesem Beitrag wäre ich also auch sehr dankbar!!

Viele Grüsse

Marc

Hi

bei uns an der Uni in Würzburg Arbeitet eine Komplette Arbeitsgruppe an Dionea, zwar nicht im Bezug auf in vitro sondern eher auf Genom, Drüsen, Tasthaare....

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  • 2 weeks later...
Mightymaster

So Leute..

hier mal das erste Update:

Ich hab vor etwas als über einer Woche das Medium für Dionaea muscipula hergestellt. Für die Etablierung wurde 1/2 MS mit 1mg/l Kinetin gewählt. Insgesamt hab ich 2 Liter hergestellt.

Hier mal das Ausgangsmaterial:

post-1239-0-48855500-1344445174_thumb.jp

Natürlich war noch mehr und auch die grüne Variante vorhanden. Geerntet wurden die jüngsten Neutriebe, da sie die größten Regenerationseigenschaften aufweisen. Wenn sie schon ansatzweise Fallen haben, ist die Sterilisation sehr schwierig (hab spaßeshalber mal eine kleine Falle genommen...war nach 7 Tagen voll mit Pilzen^^ )

Geerntet sah das ganze so aus:

post-1239-0-81524000-1344445184_thumb.jp

Hab insgesamt so ca. 60 rote und 60 grüne Blätter geerntet.

hier mal der Maßstab:

post-1239-0-78346700-1344445194_thumb.jp

Nun zur Sterilisation:

Die Blätter wurden zunächst für 30s in 70% Ethanol gelegt.

Anschließend haben wir 2 Sterilisationsmethoden angewendet: A 1% NaOCl + Tween für 10 min

B 6% NaOCl + Tween für 4 min

6% ist schon relativ hoch, aber da D. muscipula recht robuste Blätter und keine komplexen Oberflächenstrukturen hat (im Gegensatz zu Pinguicula) sollte die Blätter das hoffentlich gut überstehen.

Hier seht ihr die Blätter im Magnetrührer:

post-1239-0-41865600-1344446233_thumb.jp

So, nachdem die Sterilisationszeit abgelaufen war, wurden die Blätter auf das Medium überführt.

Hier mal die Sterilbank:

post-1239-0-46532700-1344445265_thumb.jp

Links kann man den coolen Brenner erkennen, der per Fußpedal angemacht wird. Nach jeder Überführung auf ein Medium müssen die Werkzeuge wieder Sterilisiert werden (erst in Ethanol, dann in den Brenner halten). Alles dort drinnen ist (jedenfalls sollte es so sein :cool: ) steril. In der Rückwand ist ein Gebläse, das die Luft rauspustet, um eine Kontamination durch die (z.B. mit Sporen "belastete") Außenluft zu verhindern.

Aufgestellt sah das dann so aus:

post-1239-0-98971900-1344445273_thumb.jp

sind so circa 120 Explantate.

Nach 7 Tagen haben wir dann die erste Bonitur durchgeführt, d.h. Kontaminationen untersucht und notiert.

hier mal zwei gesunde Explantate:

post-1239-0-08119800-1344445288_thumb.jp

post-1239-0-80600000-1344445292_thumb.jp

die gelbe Färbung des Mediums kommt von den Blättern, die vermutlich Anthocyane abgeben. Auffällig ist, dass nur einige betroffen sind. Die Vermutung liegt nahe, dass nur die rote Variante welche abgibt, aber es sind auch grüne dabei. Ein Problem war es, die roten und grünen Varianten nach der Sterilisation zu unterscheiden, da sie sehr dunkel wurden und sich ähnelten. Spätestens wenn sie dann Sprosse bilden wird man das erkennen.

Und hier mal 2 Kontaminationen:

post-1239-0-64040500-1344445299_thumb.jp

hier seht ihr einen typischen Pilzbefall. In ein paar Tagen wird er das ganze Medium überwuchert haben.

und hier eine Bakterienkontamination:

post-1239-0-71753200-1344445305_thumb.jp

erkennbar an der Schleimbildung um das Explantat.

So, also als bisheriges Ergebnis kann man sagen dass die Kontaminationsrate der Explantate bei der A Variante wie erwartet höher ist: A = 28% und B = 13%

Meine Partnerin hat das ganze für Pinguicula Hybriden und Drosera Capensis gemacht. Bei beiden wurden die Meristeme in der Mitte rausgeschnitten und aufs Medium überführt. Die Sterilisation wurde geringer gewählt, da beide deutlich weicheres gewebe haben. Die Explantate sahen nach 7 Wochen etwas schlechter aus (Besonders bei Capensis). Mal schaun :)

Hat richtig Spaß gemacht, war aber auch ziemlich langwierig (allein schon die Beschriftung von den ganzen Petrischalen :-) )

In ungefähr 4-6 Wochen wird man dann die ersten Sprosse (hoffentlich) erkennen können. Wenn das soweit ist, werden die Sposse auf verschiedene Medien überführt, um das optimale zu bestimmen.

hoffe es gefällt euch..hehe

mfg

Felix :cool:

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Hallo Felix,

also ich habe ja nun mal gar keine Ahnung davon, aber dein ausführlicher Bericht ist einfach nur klasse. Ich hoffe auf zahlreiche Updates.

Großes Kompliment und Gruß

Wolfgang

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Das sieht ja richtig gut aus! :) Weiterhin viel Erfolg! Das wird bestimmt auch mal was für nen lesenswerten Artikel, wenns fertig ist ;)

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Hallo Felix,

vielen Dank für den tollen Bericht mit den super Bildern! Ich freue mich schon auf Updates!

Zwei Fragen habe ich allerdings, könntest du vieleicht auch etwas zur Sterilisation der Droseras schreiben? Also welche Mischung, wie Lange und welches Nährmedium bei wie hohem Erfolg / Nichtkontamination? Wenns nicht in den Thread passt (wo es ja eher um die Dionaeas geht) auch gerne per PN.

Ich habe selber kaum Ahnung von Biologie und habe zwar einige Berichte zum Thema Sterilkultur gelesen, aber für mich bleibt eine Frage immer offen:

Wäre es theoretisch möglich, das Pflanzenmaterial auch nur in 70% Ethanol zu sterilisieren, evtl. bei verlängerter Anwendung (was natürlich irgendwan auch Gefahr für die Pflanze selbst ist? Wären die Chancen einer erfolgreichen Serilisation einfach nur schlechter, oder wären die Chancen praktisch gesehen 0 weil irgendwelche sehr häufigen Pilze / Bakterien das ganze problemlos überleben? Ginge sonst eine kurze Behandlung bei 110°C unter einem Bar Druck? Oder hat die Pflanzen da auch bei extrem kurzer Behandlung keine Chance (das sie bei normal langer Behandlung selbst abstirbt ist mir natürlich klar).

Viele Grüße und vielen Dank,

Jan

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Mightymaster

Dankeschön :-)

@Jan

Also Drosera capensis hatte auch 2 Sterilisationmethoden: A 1% NaOCl + Tween für 5 min

B 1% NaOCl + Tween für 10 min

Die NaOCl konzentration wurde deshalb so gering angesetzt, da capensis sehr weiches, wenig robustes Gewebe hat (und weil bisher veröffentlichte Publikationen in Bezug auf Droseras dies zeigten :) )

Etabierungsmedium ist einfach nur 1/2 MS medium mit einem Vitaminmix, 3% Saccharose bei einem pH-wert von 5,7 -5,8.

Die Kontaminationsraten waren höher als bei Dionaeas, aber genaue zahlen kann ich nicht sagen, da ich das nicht direkt bearbeitet habe. Die sahen auch alle ziemlich braun aus. Also in 4-6 Wochen kann ich sagen ob da noch was wächst oder nicht.

So und zur Sterilisation:

Also theoretisch ist es möglich seine Explantate nur mit Ethanol zu sterilisieren. Im Praktikum hatten wir Veilchenblätter, die wir 30s in Ethanol getaucht haben und danach mit destilliertem Wasser "sterilisiert" haben (als Nullkontrolle in so einem "Was-ist- die- beste- NaOCl-sterilisationskonzentration- bzw Zeit-Versuch"). Die haben nach 4 Wochen keine Kontaminationen gezeigt (spätestens nach einer Woche wären welche zu erkennen gewesen) und sind prächtig gewachsen. Aber 70%iges Ethanol ist schon ziemlich hart und greift das Gewebe an. Es ist immer sehr schwierig die optimale Sterilisation herauszufinden. Einerseits mus man alle Bakterien und Pilze abtöten aber andererseits das Gewebe möglichst nicht zu stark schädigen.

Eine Behandlung unter 110° und Druck für kurze Zeit würde nicht funktionieren. Also ich weiß jetzt nicht, wie das für die Pflanze ist, aber ich geh mal stark davon aus, dass sie abstirbt. Aber wichtiger ist noch, dass diese Behandlung von z.B. Sporen überlebt wird. Ein Autoklav hat 121°C unter Druck in feuchter Umgebung für 20 min um die Sporen sicher abzutöten (100%ig sicher kann man nie sein).

Felix

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Andreas Wistuba

So und zur Sterilisation:

Also theoretisch ist es möglich seine Explantate nur mit Ethanol zu sterilisieren. Im Praktikum hatten wir Veilchenblätter, die wir 30s in Ethanol getaucht haben und danach mit destilliertem Wasser "sterilisiert" haben (als Nullkontrolle in so einem "Was-ist- die- beste- NaOCl-sterilisationskonzentration- bzw Zeit-Versuch"). Die haben nach 4 Wochen keine Kontaminationen gezeigt (spätestens nach einer Woche wären welche zu erkennen gewesen) und sind prächtig gewachsen. Aber 70%iges Ethanol ist schon ziemlich hart und greift das Gewebe an. Es ist immer sehr schwierig die optimale Sterilisation herauszufinden. Einerseits mus man alle Bakterien und Pilze abtöten aber andererseits das Gewebe möglichst nicht zu stark schädigen.

Ethanol hat zwar auch eine Sterilisationswirkung, aber der Ethanol-Schritt vor dem Einsatz der Chlorbleichlauge hat eigentlich die Funktion eine gute Benetzung des Explantats zu erreichen. Das macht man, um Luftblasen auf dem Gewebe zu vermeiden. Das wären dann nämlich Stellen, wo die Lauge nicht hinkommt und wo in Folge nicht sterilisiert werden kann. Ausserdem gibt es Sporen, denen das 70% Ethanol nicht viel ausmacht, weshalb auch mittlerweile vom sterilisieren der Werkzeuge in Ethanol mit kurzem Abflammen eher abgeraten wird. Früher machte man das gerne.

Viele Grüße

Andreas

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