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Invitro im Hobbybereich


Tobias Kulig

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Tobias Kulig

Hallo zusammen,

 

wie angekündigt, werde ich nun hier mal meine Vorgehensweise bei der Invitro-Kultur zeigen. Es sei erwähnt, daß ich mir mein Wissen über Literatur und Internet (unter anderem auch hier im Forum) selbst angeeignet habe. Auch bin ich kein Chemiker mit Fachwissen! 

 

Und da dieses Thema ziemlich umfangreich ist, werde ich es je nach Lust und Zeit staffeln. Also nicht wundern, wenn es zwischendurch einfach mal aufhört. 

 

In das Thema Invitro bin ich erst seit kurzem wieder eingestiegen, nachdem ich ein paar Jahre lang andere Prioritäten (Haussanierung ect.) hatte. Bevor ich damals angefangen habe, mir die ersten Gerätschaften anzuschaffen, hatte ich mich 1,5 Jahre erstmal richtig ins Thema eingelesen und mich intensiv damit beschäftigt. 

 

Es ist echt schwer, hier richtig zu beginnen. Ich habe auch kein Konzept vorher gemacht. Ich sitze hier nun vor meinem IPad und schreibe frei Kopf! Ich lese auch nirgends ab. Das ist aber das Gute: Es ist wie Fahrradfahren, man verlernt es nicht! Ok, ich beginne einfach mal......

 

Das Herz jedes Sterilraumes ist die sterile Werkbank (LFH, Laminar Flow Hood) auf Bild 1. 

Ohne diese ist steriles arbeiten zum scheitern verurteilt! Gleich mal vorab: Will man das ernsthaft angehen, geht das ans Geld! Einfach mal kurz probieren, könnt Ihr knicken! Das funktioniert nicht! 

Es gibt zwar einige Beschreibungen im Netz, wo man z.B. vom arbeiten über Dampf ect. spricht: Aber das ist Pfusch! Es mag im Einzelfall durch Glück mal klappen, aber der Frust wird kommen!

Meine LFH ist übrigens selbstgebaut! Nach der Bauanleitung von Lotte % Thomas. Das ist so ein Orchideenforum. Gibts, glaube ich, noch. Einfach mal googlen. Aber wenn man Glück hat, findet man auch mal ne Gebrauchte bei Eb... Aber auch da kosten sie noch richtig Geld. Ich hab mir einfach die entsprechenden Komponenten laut Anleitung zusammengekauft. Das teuerste ist der Hepa H14 Filter und das Gebläse. Der Rest ist PillePalle. Obwohl, heute auch nicht mehr. 

 

Das zweitwichtigste Gerät ist der Autoklav (Bild 2) zum sterilisieren der Nährmedien. Dieser arbeitet mit 121 Grad und 1 bar Druck. 15 Minuten reichen. Es ist alles voreingestellt. Ich warte einfach nur ab, bis die Zeitschaltuhr abgelaufen ist.

Meinen Melag 23 hab ich damals bei Eb.. geschossen. Er ist relativ klein. Es passen zwar nur 9 Gläser rein, aber mir reichts. Und in diese 9 Gläser passen 1/2 Liter Medium. Das heißt, ich muß die Mengenangaben der Nährböden entsprechend halbieren. Aber dazu kommen wir später.

 

So, der erste Teil wäre fertig. Aber keine Angst, es kommt noch einiges. Vielleicht schon heute Mittag, oder Abends. Dann gehts um Nährböden, Besteck und Zubehör.

 

Gruß

Tobias

 

 

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Eike Matthias Wacker

Im Studium damals haben wir statt eines echten Autoklaven auch öfters einen einfachen Schnellkochtopf zur Sterilisierung von Medien genutzt, funktioniert auch. #UniOhneGeld

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Tobias Kulig

Servus Eike,

mag funktionieren! Ein Autoklav ist im Grunde nix anderes! Aber ich mach lieber gleich Nägel mit Köpfen. Zudem ists bequemer: Ich zieh das Tray mit den Gläsern raus, stells auf den Herd und mach die Deckel zu und drück die Alufolie an.

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Tja und manchmal landen ebensolche Autoklaven einfach auf dem Müll, weil keiner sie mehr z.B. in der Schule nutzt bzw. das Arbeiten mit Kindern so vielen Sicherheitsbestimmungen unterliegt, dass es in der Praxis nicht mehr umsetztbar ist ...

 

Zum Topic zurück: Klasse Tobias, dass du einen Anfang gemacht hast ? Weiter so!

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Hi Tobias,

 

na das sieht ja mal recht aufwändig aus was du da gebaut hat ?

 

ABer ich bin echt mal gespannt was deine Arbeiten so an Ergebnissen hergeben.

 

Kleiner Klugscheißer-Nachtrag meinerseits:

 

Wirklich steril wird diese konstrukt nicht sein. Gemäß den Klassen von mikrobiologischen Sicherheitswerkbänken würde ich diese (nach dem Bld welches du geteilt hast) als Klasse I - Werkbank einstufen, bedeutet: Du und deine Umgebung (Zimmer o.ä.) sei geschützt von dem was du da unter der Bank tust, jedoch genau deine Pflanzen (bzw was auch immer du darunter verarbeitest) dann nicht. Demnach würde ich, wenn es wirklich möglichst richtung "steril" gehen soll, mal die Luft des jeweiligen Zimmers checken lassen. Insbesondere Schimmelsporen etc. sind ja kein unbekanntes Thema in einer WOhnung. Wenn das Gebläse nun die Luft richtung HEPA filter aus der Wohnung zieht, kann da gut und gerne auch phytopathogene mit reingezogen werden. welche deine ,,Proben" verunreinigen.

Ich gehe mal davon aus dass es keine Luftschranke an der offenen Seite deiner Werkbank gibt? Denn das würde Wahrscheinlichkeit eines sterilen Raumes in der Werkbank sehr erhöhen.

Wie desinfizierst du den Innenraum deiner Wwrkbank? EInfache Wisch-Desinfektion, oder hast du auch UV-Lampen welche du nach der Arbeit drinne aufstellen kannst zum desinfizieren? Fragen über Fragen ?

Klugscheißer-Modus aus.

 

... dass man auch solch mini-autoklaven einfach so privat haben/besorgen kann, finde ich auch recht interessant!

 

Bin auf jeden Fall gespannt was du so da drunter machst, ich werde diesen Thread gerne verfolgen ?

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Tobias Kulig

Hi,

 

ich denke schon, daß meine Bench steril ist! Kontaminationen habe ich jedenfalls keine! Natürlich hatte ich auch schon hin und wieder eine, betraf aber nur 1 Glas, vielleicht auch mal zwei. Aber die waren echt selten. Sogar mein allererstes Glas war ein Erfolg. 

So aufwendig ist diese Bench eigentlich gar nicht aufgebaut: Ganz oben ist auch noch ein Vorfilter drauf! Der hintere, hohe Teil hat zwei Kammern: Eine obere, wo das Lüftergebläse auf den Trennboden geschraubt ist. Und eine untere, wo der Luftstrom ankommt und durch den Hepa gedrückt wird.

Ich wische den Arbeitsbereich mit 70% Iso aus und lass dannach die Bench erst 5-8 min laufen. Dann ist auch der Glasperlensterilisator auf Temperatur. Aber auf das alles gehe ich später natürlich auch noch ein. Bitte Geduld...

 

Gruß

Tobias

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Tobias Kulig

Und spontan gehts weiter.....

Folgendes Zubehör wird auch benötigt:

 

Bild 1: Magnetrührer mit Wärmeregler, normale Kaffeekanne, pH-Meter mit 0,01 Auflösung 

Damit rühre ich meine Medien an. Das mache ich ganz unkompliziert auf dem Küchentisch. Auf die Herstellung eines Nährmediums gehe ich später gesondert ein. 

 

Bild 2: Glasperlensterilisator

Achtung, Sicherheitsrelevant!!! Kommt ja nicht auf die Idee, eine offene Flamme zum desinfizieren Eures Bestecks im Arbeitsbereich aufzustellen!!! Wenn Ihr die Flamme mal aus Versehen mit 70% Isopropylalkohol anhustet, hattet Ihr die längste Zeit blonde Haare!

Besorgt Euch einen Glasperlensterilisator, da steckt Ihr Eure Pinzetten, Skalpelle ect. für ein paar Sekunden rein und das Zeug ist sauber. Die Dinger bleiben auch stecken, nur halt nicht vergessen. Wird echt heiß.....

 

Bild 3: Feinwaage mit 0,01 Auflösung (das reicht).

Damit könnt Ihr Eure Medien und deren Zutaten abwiegen.

 

Bild 4: Besteck

Pinzetten, Skalpell (mach ich jetzt nicht extra auf, steril), Impfnadel (Damit impfe ich die sterilisierten Samen aufs Medium), Abdichtungsfolie für die fertigen Gläser.

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Edited by Tobias Kulig
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Tobias Kulig

Guten morgen zusammen,

weiter gehts. Des weiteren benötigt Ihr:

 

Bild 1: Kulturbehälter mit Klarsichtdeckel

Die gezeigten Gläser zeigen aktuell meine ersten Gläser nach der langen Pause. Die Samen keimen bereits und müßten demnächst loslegen.

Die meisten Leute verwenden aber PP-Becher mit dazugehörigem Deckel. Ich persönlich nehme normale Haushaltsgläser mit 82mm Deckel (Standardgröße). Die mitgelieferten Metalldeckel muß man halt durch Klarsichtdeckel ersetzen. Die PP-Becher haben mir früher nach dem autoklavieren immer Probleme bereitet, da der entstehende Unterdruck beim abkühlen die Becher zusammengefaltet hat.

Wichtig: Während dem autoklavieren legt man die Deckel nur lose auf die Behälter (nicht zuschrauben wegen des entstehenden Drucks!!) und macht Alufolie drüber (mit den Händen schön umformen, daß sie schön anliegt). Die Alufolie wirkt antiseptisch. Nachdem ich die autoklavierten Gläser rausgeholt habe, warte ich noch 10min und schraube dann die Deckel fest. Und drücke die Alufolie wieder an. Denn diese verdreht sich beim Festschrauben etwas. Wenn man das vorsichtig macht, gehts schon. Dann lass ich das Ganze abkühlen. Wenn man PP-Becher nimmt, muß man die halt deutlich länger abkühlen lassen, daß sich die Becher nicht verziehen, wie oben erwähnt. Ich bleib aber bei den Gläsern......

 

Bild 2: 

Steriles Wasser! Ist normales, destilliertes Wasser, welches halt autoklaviert wurde. Vergewissert Euch vor jeder Sitzung, daß Ihr welches parat habt. Ist zu meinen Anfängen durchaus schon vorgekommen, daß ich was sterilisiert habe und dann dagesessen bin. Sowas ist echt ärgerlich!

 

Bild 3: weiße, runde Kaffeefilter

Die werden entsprechend gefaltet und dienen zum Samen sterilisieren. Rund und weiß ist von Vorteil. Wenn man sie richtig faltet, kann man sie sehr gut mit einer Pinzette auseinander dröseln. Denn wenn sie nass sind, kleben sie wie Sau! Ihr dürft dabei nie Kante auf Kante falten! Das kriegt Ihr ohne Aufwand nicht auseinander. Und bei weißem Filterpapier kann man die Samen besser sehen. 

 

Bild 4:

Mundschutz. In der heutigen Zeit kaum noch zu sehen.....

Einweghandschuhe

Gehörschutz. Der Geräuschpegel der LFH ist nicht zu unterschätzen

 

Bild 5:

70% Isopropylalkohol (Gibts in 5L Gebinden problemlos auf Eb..)

 

.....später gehts weiter....

 

 

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Super post, thank you, it's really very interesting,
have you ever grown tuberous in vitro, which way do you use if this is the case?
where have you found the transparent plastic covers that can be used on jam jars?

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Tobias Kulig
vor 1 Stunde schrieb jp95:

Super post, thank you, it's really very interesting,
have you ever grown tuberous in vitro, which way do you use if this is the case?
where have you found the transparent plastic covers that can be used on jam jars?

Hi,

thank you for your positive feedback! No, i dont have try tubers in the past. I think the problem is here the sterilisation of the tubers. I would try 1/4MS, 20g suchrose (sugar), pH 5.65, charcoal for darkness.

The lids i have found at eb.. in mass before many years. But now i have no found it. Try google....

 

regards

Tobias

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Tobias Kulig

Hallo zusammen,

 

heute gehe ich auf die Herstellung meiner Nährmedien ein. Es handelt sich eigentlich nur um ein Standardmedium, welches man in der Konzentration verändern kann.

Viele berufliche Anwender haben natürlich ihre eigenen Rezepte, die sie im Laufe vieler Jahre selber modifiziert haben. Sie werden diese auch mit Sicherheit niemals preisgeben. Dies muß auch respektiert werden, da es ganz einfach Berufsgeheimnisse sind!

Da aber mein Schwerpunkt Drosera sind, genügen mir aber die Standardmedien. Drosera wachsen darin bestens. Die Konzentration hängt dabei aber von der jeweiligen Art ab!

 

Bild 1: Ich verwende ausschließlich MS Medium mit Vitaminen (Gibts aktuell bei Eb..). Das gezeigte Gebinde ist ausreichend für 10 Liter Medium, aber in 100%iger Konzentration! Diese ist für Karnivoren aber viel zu hoch! Man verdünnt sie in der Regel auf 50%, 30% oder 25%. Das heißt, man muß es je nach Wunsch individuell berechnen. Die Rezepturangabe auf dem Gebinde bezieht sich immer auf einen Liter. In diesem Fall 4,408g/L. Das heißt, will man 1/2 Stärke (50%), ist es logischerweise die Hälfte. Entsprechend der gewünschten Konzentration dann einfach anpassen.

Speziell in meinem Fall (ich mach ja nur nen halben Liter) machen wir jetzt eine Berechnung für 1/3 MS (ich gebe es jetzt deshalb extra so an, weil Ihr es im englischen so lesen werdet, wenn Ihr recherchiert. Das meiste ist englischsprachig):

 

4,4g/L : 3 = 1,46g/L

Das wäre jetzt 1/3 Strenght für einen Liter. Ich selber muß es jetzt natürlich noch halbieren für einen halben Liter.

Ich fülle jetzt einen halben Liter destilliertes Wasser in meine Kaffeekanne und gebe 0,73g Medium (feines Pulver) dazu. Und das natürlich mit dem Magnetrührer. Wir heizen im Moment aber noch nicht!

 

Es muß aber noch Zucker in die Suppe. Ich verwende ganz einfachen Haushaltszucker. Es gibt durchaus spezielle Sacharose für Invitro. Aber normaler Zucker funktioniert auch sehr gut. Eigentlich rühre ich diesen grundsätzlich vor dem MS dem Wasser unter und lasse den Zucker dann gut lösen. Die Menge ist aber auch artabhängig. Aber der Standard ist 30g/L (bei mir dann entsprechend 15g für den halben Liter).

 

So, jetzt müssen wir den pH-Wert einstellen. Ich stelle grundsätzlich 5.65pH ein (Sollwert ist 5.6 bis 5.8). Ich habe ein pH-Meter mit einer 2 Punkt Kalibrierung. Ich eiche meinen vor jeder Herstellung. Das ist aber abhängig, was Ihr für einen besorgt. Deshalb überspringe ich diesen Punkt.

Ihr stellt das pH-Meter in Euer Medium und wartet erstmal ab, was für ein aktueller Wert angezeigt wird. Bei mir wird immer so ungefähr 4.6pH plus/minus angezeigt. Und da wir auf 5.65 wollen, müssen wir ihn jetzt komplett etwas hochfahren: Mit normalem Backpulver. Füllt ein kleines Glas mit destilliertem Wasser und gebt Etwas Backpulver dazu. Es wird dann schäumen (ist ne Reaktion). Dann zieht ihr ne kleine Spritze (1ml, mit kleiner Kanüle) damit auf und gebt winzige Mengen (!!!) in Euer Medium. Aber echt aufpassen! Lieber in kleinen Etappen an den Sollwert nähern, als nacher wieder senken zu müssen. Ich mach das mit verdünntem Essig. Sollte man eigentlich nicht, ist phytotoxisch. Ich hab bei meinen Drosera aber noch nie was negatives feststellen können.

Profis arbeiten hier mit 3% Salzsäure zum senken und 3% Natronlauge zum erhöhen. Aber das ist echt ne heikle Nummer und kann bei unsachgemäßer Handhabung gefährlich werden. Ihr wollt ja nicht, daß man Euch in Zukunft alles vorlesen muß. Deshalb gebe ich diesbezüglich hier keine Informationen!

Ist der Sollwert erreicht, kommt jetzt das Geliermittel zum Einsatz:

 

Bild 2 und 3: Phyto Agar oder Gelrite:

Gelrite hat den Vorteil, daß es Glasklar ist. Man entdeckt Kontaminationen schneller.

Phyto Agar ist aber trotzdem mein Favorit (warum auch immer). Hier muß man die gewünschte Festigkeit selber rausfinden. Für meinen inzwischen berüchtigten halben Liter wiege ich immer 1,8g ab und habe meine perfekte Festigkeit: nicht zu hart und schön glibbrig. 

 

So, das Agar ist jetzt abgewogen in einer Petrischale. Jetzt schalte ich an meinem laufenden Magnetrührer die Heizung an. Jetzt lasse ich die Suppe leicht erwärmen. Ich mach das nach Gefühl und Erfahrung. Jetzt schütte ich das Agar ins Medium und lasse es gut unterrühren. Die Gläser, Klarsichtdeckel und Alufolie sind vorbereitet! 

Jetzt nehme ich eine 100ml Spritze und dosiere das fertige Medium unter ständigem Rühren des Magnetrührers in die Gläser. Ist das geschehen, lege ich die Klarsichtdeckel nur lose auf die Gläser und forme abschließend die zurechtgeschnittene Alufolie mit den Händen über Deckel und Gläser. Jetzt schiebe ich das Tray mit den Gläsern in den Autoklaven. Die Zeitschaltuhr ist bei mir auf etwa 33min eingestellt. Das hab ich austüffteln müssen unter Berücksichtigung der Vorwärmzeit, das eigentliche autoklavieren (15min) und der abschließende Druckablass.

 

So, im Großen und Ganzen wars das schon. Ich hoffe, es ist einigermaßen verständlich (wie erwähnt frei Kopf, ich hab halt die Bilder gemacht). 

 

Beste Grüße

Tobias

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Edited by Tobias Kulig
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  • 4 weeks later...
Tobias Kulig

Hallo zusammen,

demnächst geht es weiter mit dem eigentlichen arbeiten in meiner Werkbank. Hier erkläre ich dann meine Vorgehensweise während einer Sitzung.

 

Hier mal 2 Gläser mit D. chrysolepis und D. curvipes. Ich hatte tatsächlich jeweils 100% Keimrate. Wobei das Medium eine Spur zu dünnflüssig ist. Anfänglich versanken die Sämlinge etwas, was aber dem Wachstum keinen Abbruch tut. Jetzt gehen die Sämlinge in die Höhe. Allerdings werde ich beim nächsten Mal 0,2g mehr Phytoagar reinmachen....

 

Beste Grüße

Tobias

 

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FlorianO

wenn du doch mal die Kunstoffbecher benutzen willst. Am besten den Autoklav auf 1 Bar einstellen und ein kleinen streifen Hitzefesten dünnen Filz oder ähnliches zwischen Deckel und Becher klemmen den man nach dem Abkühlen einfach rausziehen kann.

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Tobias Kulig

Hey Florian,

 

vielen Dank für den Tipp! Noch ein Grund für mich, bei den Gläsern zu bleiben, ist der, daß die Gläser einen kleineren Durchmesser haben. So bekomme ich exakt 9 Gläser auf das Tray. Die Becher sind etwas größer, dann sinds entsprechend weniger.

 

Was machst Du so invitro?

 

Grüße

Tobias

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  • 4 months later...
Tobias Kulig
Posted (edited)

Hallo,

nun es war an der Zeit, die D. chrysolepis aus dem Glas zu holen, denn es wurde echt eng da drin. Diesen Vorgang nennt man dann Exvitro! Dieses Mal dauerte es etwas länger als gewöhnlich, warum auch immer. Denn normalerweise hole ich die Pflanzen nach 3-4 Monaten aus dem Glas. Trotzdem bin ich sehr zufrieden, da die Pflänzchen sehr kräftig sind und ne gute Größe haben.

Da die Pflanzen im Glas nur sehr hohe Luftfeuchtigkeit kennen, kann man die nun folgende Vorgehensweise trotzdem offen durchführen. Ich mach das immer am Esszimmertisch. In dieser kurzen Zeit schadet es den Pflanzen nicht.

 

Bild 1: Hier sieht man das noch geschlossene Glas und vor allem, wie eng es jetzt da drin ist.

 

Bild 2: Mit Hilfe eines Teelöffels hab ich den kompletten Inhalt rausflutschen lassen. Die Pflanzen befinden sich immer noch im Nährboden, welches wie ein Kissen wirkt.

 

Bild 3: Nun ziehe ich die einzelnen Pflanzen mit einer Pinzette aus dem Nährboden raus und lege sie in ein regenwassergefülltes Gefäß. Ein alter Suppenteller ist hier ideal. Aber jetzt müssen die Wurzeln noch gespült werden, denn die Reste des Nährmediums müssen vollständig entfernt werden! Ich mach das unterm fließenden Wasserhahn mit normalem Leitungswasser.

 

Bild 4: Dann lege ich die gespülten Pflanzen wieder in frisches Regenwasser.

 

Bild 5: Die Töpfe hab ich vorab schon vorbereitet. Bei D. chrysolepis verwende ich totes, gehacktes Sphagnum, Sand, Torf etwa 2:2:1. Mit einem Pikierstab entsprechende Löcher machen, Pflanze rein und locker mit der Pinzette zudrücken. Zum Schluß mit einem sanften Wasserstrahl zuschlämmen. Fertig.

 

Bild 6: WICHTIG: Für die nächsten 2 Wochen unter hoher Luftfeuchte anwachsen lassen. Ich verwende hier die geläufigen Zimmergewächshäuschen. Für einen Luftaustausch hebe ich einmal täglich die Abdeckung komplett ab und setze sie sofort wieder drauf. Dann nach und nach die Pflanzen an die normal gegebene Luftfeuchte gewöhnen. 

Der zweite wichtige Tipp: Am Anfang niemals der direkten Sonne aussetzen!! Hier gibts aber genug Möglichkeiten, die Pflanzen schonend an die Sonne zu gewöhnen: Ich persönlich stelle so ein Minigewächshäuschen im Sommer ins Freie zwischen die großen Topfpflanzen. So bekommen sie nur indirektes Licht. Man kann auch Reste von einem Schattiernetz drüberlegen. Dies muß aber jeder selber entscheiden. 

 

Beste Grüße

Tobias

 

 

 

 

 

 

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Edited by Tobias Kulig
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Hallo Tobias,

 

wieder spannend zu lesen. Wenn ich das so verfolge, dann kann man immer hoffen, dass es bei dem Aufwand auch wirklich die gewünschten Pflanzen sind. Ich stelle mir gerade vor wie da dann überall D.capensis wachsen, nachdem man so viel Aufwand betrieben hat. 

Mit der Salzsäure und der Natronlauge sollte es aber auch gut gehen. Das ist abgewandelt auch ein klassischer Schülerversuch zur Neutralisation bzw. Indikatorfunktion. Eine Schutzbrille zu tragen macht da halt schon Sinn.


Sehr schöner Artikel und eine tolle Dokumentation deines Vorgehens.
 

Vielen Dank!

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Tobias Kulig

Hallo,

vielen Dank! Ja, D. capensis invitro lohnt sich definitiv nicht. So ein Aufwand ist es auch mal wieder nicht! Wenn es automatisiert abläuft, gehts eigentlich Ruck Zuck. Nährbodenzubereitung ca. 1h, Eine Sitzung vor der Bench je nach Menge der Arten. Ich mach meistens so 4 Arten, ca. 1h.

Das holt man locker wieder rein: Wenn man die Gläser fertig hat, braucht man nix mehr machen bis das Glas voll ist. Dann noch das Exvitro, auch etwa 1h.

 

Gruß

Tobias

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Sonja Schweitzer

Der größte "Aufwand" ist dann wahrscheinlich der Finanzielle zu Beginn, oder?

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Tobias Kulig

Ganz genau, Sonja! So siehts aus! Die Verbrauchsmaterialien kommen auch nicht auf einmal. Man muß halt vor jeder Sitzung darauf achten, daß alles da ist. Wie weiter oben erwähnt, schaue ich als erstes auf steriles Wasser....

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